益母草堿抑制人腦血管外膜成纖維細胞增殖并促進細胞凋亡的機制研究

伍蘭萼 章青青 郭倩 熊衛標

近年來，全球心血管疾病的發病率和病死率呈上升趨勢[1]。血管重構是多種心血管疾病的病理基礎。先前關于血管重構的研究主要集中在血管內膜和中膜的功能上，包括內皮細胞和平滑肌細胞[2]。最近越來越多的研究關注外膜的作用，外膜成纖維細胞(adventitial fibroblasts，AFs)是外膜中的主要細胞類型[3,4]。研究表明，AFs參與炎性反應、血管重塑和再狹窄[5]。AFs增殖和凋亡的平衡對于脈管系統的生理至關重要[6]。益母草堿是從唇形科植物益母草中提取的有效化合物成分，已被證實具有抗腫瘤和心臟保護的潛力，對急性心肌缺血和心肌缺血再灌注的心肌具有保護作用[7,8]。有研究顯示，益母草堿能夠抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡，提高細胞增殖活力[9]。目前尚無關于益母草堿對AFs作用的報道，因此本實驗旨在探究益母草堿對人腦血管外膜成纖維細胞(human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)增殖和凋亡的影響，并探究其作用機制，以期為益母草堿用于心血管疾病的治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦血管外膜成纖維細胞株(HBVAFs)購于美國ScienCell公司；益母草堿、MTT試劑、二甲基亞砜(DMSO)和NF-κB信號通路激活劑佛波酯(PMA)購于美國Sigma公司；DMEM高糖培養基購于美國HyClone公司；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒購于美國BD公司；細胞周期檢測試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒和SDS-PAGE凝膠試劑盒購于碧云天生物技術研究所；ECL化學發光檢測試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司；NF-κB p65單抗、IKK-α單抗和IKK-β單抗購于美國CST公司；IgG二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 HBVAFs培養 取出凍存的HBVAFs，復蘇后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液(含1%青霉素-鏈霉素雙抗)重懸并培養，放置在體積分數為5% CO2、37℃、飽和濕度的培養箱中，在顯微鏡下觀察細胞生長情況，24 h后更換新鮮培養液，待細胞生長匯合至90%左右時加入胰蛋白酶消化細胞，收集分裝進行傳代培養，采用第3代的細胞進行后續實驗。

1.3 MTT實驗檢測益母草堿對HBVAFs增殖活力的影響 對數期的HBVAFs接種到96孔板中，過夜培養，待細胞完全貼壁生長后，用不同濃度(0、5、10、15、20 μmol/L)的益母草堿干預細胞，其中對照組為0 μmol/L的益母草堿，空白組只加DMEM高糖培養基不加細胞，各組細胞處理48 h后，每孔細胞依次加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，放置在37℃培養箱繼續培養4 h，取出96孔板，吸去細胞上清液，每孔細胞依次加入DMSO 150 μl，振蕩反應直至結晶物充分溶解。采用全自動酶標儀測定每孔細胞的吸光度值(A值)，檢測波長為450 nm，分別計算各個濃度的益母草堿對HBVAFs增殖能力的影響，細胞增殖率(%)=(藥物組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。采用GraphPad Prism 7.0軟件計算益母草堿干預HBVAFs 48 h半數抑制濃度(IC50)。

1.4 HBVAFs分組和處理 對數期的HBVAFs接種到6孔板中，實驗分為Control組、Leonurine組和Leo+PMA組。其中Control組HBVAFs不加任何處理，Leonurine組HBVAFs以10 μmol/L益母草堿干預48 h，Leo+PMA組HBVAFs以10 μmol/L益母草堿和1 μmol/L NF-κB信號通路激活劑佛波酯PMA干預48 h。3組HBVAFs處理后收集細胞，進行相關檢測。

1.5 克隆形成實驗檢測HBVAFs克隆形成能力 用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞并種植到6孔板中，每孔種植1×103個，吹打細胞至細胞均勻分散，將6孔板放置在常規培養箱中進行培養，14 d左右出現肉眼可見細胞克隆時終止培養，以甲醇固定細胞，以結晶紫染色，洗去染色，晾干后放置在倒置顯微鏡下隨機選擇6個視野進行觀察，計數≥50個的細胞克隆數，計算各組細胞克隆形成率，克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期 對數期的HBVAFs以3×105個接種到細胞培養皿中，待細胞貼壁后按照上述1.4法分組和處理，48 h后以胰蛋白酶消化并收集細胞，以PBS洗滌細胞，以預冷的70%的乙醇固定細胞24 h，除去乙醇，PBS洗滌細胞，加入含Rnase A的PI染液，避光染色30 min，使用流式細胞儀檢測，實驗結果采用Modfit軟件分析各周期細胞比例。

1.7 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色技術檢測細胞凋亡情況 對數期的HBVAFs以1×105個/孔接種到96孔板中，培養24 h，除去原培養液，以1.4方法分組和處理，48 h后常規收集細胞，以PBS洗滌細胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒使用說明分別加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液，混勻后室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測3組HBVAFs凋亡情況。

1.8 Western blot實驗檢測NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表達 HBVAFs按照1.4方法分組和處理48 h，收集3組細胞，分別加入適量細胞裂解液，于冰上抽提總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后行SDS-PAGE電泳，蛋白樣品分離后電轉至PVDF膜上，將膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封阻2 h，孵育一抗NF-κB p65(1∶800稀釋)、IKK-α(1∶800稀釋)和IKK-β(1∶800稀釋)，4℃過夜，孵育二抗(1∶3 000稀釋)2 h，以ECL進行顯影，采用凝膠成像系統拍照，以β-actin為內參，分析各組細胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的相對表達水平。

2 結果

2.1 益母草堿對HBVAFs增殖活力的影響 隨著益母草堿濃度的升高，HBVAFs增殖率呈明顯的濃度依賴性，益母草堿對HBVAFs的IC50為12.55 μmol/L，因此后續實驗選擇10 μmol/L為加藥濃度。見表1。

表1 不同濃度的益母草堿對HBVAFs增殖活力的影響

2.2 3組HBVAFs克隆形成率比較 與Control組比較，Leonurine組克隆形成率明顯降低(P<0.05)，與Leonurine組比較，Leo+PMA組克隆形成率明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 3組HBVAFs克隆形成率比較

2.3 3組HBVAFs細胞周期進程比較 與Control組比較，Leonurine組G2/M期細胞比例明顯增多(P<0.05)；與Leonurine組比較，Leo+PMA組G2/M期細胞比例明顯減少(P<0.05)，G1期和S期細胞比例組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組HBVAFs細胞周期進程比較

2.4 3組HBVAFs凋亡率比較 與Control組比較，Leonurine組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與Leonurine組比較，Leo+PMA組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 Annexin V-FITC/PI雙染色實驗檢測HBVAFs凋亡率

表4 3組HBVAFs凋亡率比較

2.5 3組NF-κB p65、IKK-α和IKK-β表達水平比較 與Control組比較，Leonurine組細胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β蛋白表達明顯下調(P<0.05)，與Leonurine組比較，Leo+PMA組NF-κB p65、IKK-α和IKK-β蛋白表達明顯上調(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 Western blot檢測細胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表達

表5 3組HBVAFs中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β表達水平比較

3 討論

研究發現，外膜細胞在血管重塑中起重要作用[10]。在諸如損傷和細胞因子之類的病理刺激下，外膜中的主要細胞類型(AFs)被激活并發生表型變化，包括增殖和分化為肌成纖維細胞。當肌成纖維細胞的生命周期調節不當時，細胞凋亡的缺乏會導致細胞外基質蛋白沉積的過度產生和病理性血管重塑。此外，這些過程伴隨著外膜細胞向內腔的遷移，從而促進了新內膜的形成[11]。不受控制的細胞增殖和細胞凋亡的抑制是血管重構中的關鍵細胞事件[12]。因此，調控外膜成纖維細胞的增殖和凋亡在血管重塑中發揮重要作用，在多種心血管疾病的防治中扮演重要角色。傳統中藥如益母草、黃芪、鉤藤等在用于臨床治療心血管疾病中效果顯著[13]。益母草堿是臨床上常用藥物益母草的主要藥效成分，其具有抗炎、抗細胞纖維化、保護心肌、改善神經功能等多種生物學功能[14,15]。目前研究指出，益母草堿是一類治療心腦血管新藥的候選藥物[16]。然而，益母草堿對HBVAFs的影響尚無報道。因此本實驗參考以往文獻[17]和前期基礎實驗結果選擇不同濃度的益母草堿干預HBVAFs，結果發現益母草堿能夠呈濃度依賴性的抑制HBVAFs增殖活力。后續實驗以接近益母草堿干預HBVAFs的IC50為加藥濃度，實驗結果顯示，益母草堿能夠抑制HBVAFs的克隆形成，阻滯細胞周期至G2/M期，促進細胞凋亡。以上實驗結果表明益母草堿能夠抑制HBVAFs增殖并促進細胞凋亡。

NF-κB信號通路是一種廣泛存在于機體內的信號轉導途徑，具有多種調節作用[18]。研究發現，心血管疾病與NF-κB信號通路的異常激活密切相關[19,20]。NF-κB信號通路在心室重構、心肌細胞生理病理變化中的作用至關重要[21]。NF-κB與抑制蛋白IκB相互結合形成復合物，該復合物穩定存在于細胞質中，此時NF-κB處于失活狀態無調控活性。IKK-α和IKK-β是IκB激酶(IKK)復合物的亞基，當細胞受到外界刺激后，IKK-α被降解，IKK復合物被激活釋放NF-κB進入細胞核發揮調控作用[22]。本實驗結果顯示PMA可上調NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表達，且能夠逆轉益母草堿對HBVAFs增殖抑制和凋亡誘導的作用，證實了益母草堿抑制HBVAFs增殖并促進細胞凋亡與NF-κB信號通路的激活有關。

綜上，本實驗結果顯示，益母草堿能夠抑制HBVAFs增殖，阻滯細胞周期進程，誘導細胞凋亡，其作用機制與抑制NF-κB信號通路的激活有關。