利用多重熒光定量PCR方法檢測線粒體DNA拷貝數

孫國祝，路 萌，王決恒，周宇荀，李 凱，肖君華

(東華大學 化學化工與生物工程學院， 上海 201620)

線粒體拷貝數變異與許多年齡相關疾病有關，包括代謝綜合征、神經退行性疾病、心血管疾病和癌癥等。檢測線粒體拷貝數變化對于揭示細胞衰老進程以及評估個體健康水平有重要意義[1]。熒光定量PCR(polymerase chain reaction)技術是目前主要檢測線粒體拷貝數的方法，具有快速、高通量且易于使用和分析等優點[2-5]。多重熒光定量PCR技術要求內參基因和目的基因的拷貝數在相同數量級，從而保障檢測結果的準確性。據文獻[6]報道，每個細胞中含有幾百至上千拷貝的線粒體DNA。本研究從基因組數據庫中尋找一個高拷貝(300拷貝)基因作為內參基因，命名為YH-1。與單拷貝內參基因相比，高拷貝內參基因減少了與線粒體DNA拷貝數的倍數差異。同時，建立并優化了雙色熒光定量PCR方案(雙TaqMan探針法)來檢測線粒體和內參基因的拷貝數，該方案實現了內參基因和目的基因在同一管中檢測，提高檢測結果的準確性，也可節約樣本。線粒體DNA與基因組DNA共存于細胞中，不同于基因組DNA，線粒體DNA呈環狀，兩者長度大小懸殊，導致在總DNA抽提過程中會影響線粒體DNA得率，進而影響線粒體DNA拷貝數的檢測。所以本文比較了瓊脂糖包塊法、磁珠法、試劑盒法以及酚-氯仿法等不同總DNA抽提方案對線粒體DNA拷貝數檢測影響[7-8]，同時構建了穩定的質粒標準品用以檢測方案。利用該方案，隨機檢測了不同年齡段100例血樣，結果表明線粒體DNA拷貝數與年齡呈負相關。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DNA血樣采集于上海松江區中心醫院志愿者(所有研究參與者均在自主自愿的前提下簽署了知情同意書)。7500 Real Time PCR System 購自美國 Applied Biosystems 公司;Probe qPCR Super Mix 購自近岸蛋白科技有限公司；磁珠法DNA提取試劑盒購自上海木辰生物科技有限公司；瓊脂糖購自上海翊圣生物科技有限公司；柱式血樣DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，酚-氯仿DNA提取試劑盒購自上海翼和應用生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

使用4種不同方法進行了細胞基因組DNA抽提：瓊脂糖包塊法、磁珠法、試劑盒法(過柱式)、酚-氯仿法等方法，操作步驟見相關說明書。

1.2.2 DNA樣本標化

將上述4種不同提取方案所得DNA樣品稀釋至20 ng/μL，純度A260/A280≈1.8，其中，A260為DNA吸光度，A280為蛋白質吸光度，取2 μL作為模板，進行熒光定量 PCR反應。

1.2.3 引物和探針設計

依照引探針物及探針設計原則，利用Prime 3.0和Oligo 7設計線粒體及YH-1特異性上下游引物及TaqMan探針。線粒體上游引物5′-CCGACCGTTGACTATTCT-3′、下游引物5′-CCGATTATGATGGGTATTACT-3′、YH-1上游引物5′-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC-3′、下游引物5′-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC-3；線粒體TaqMan探針5′CGCATGAGCTGGAGTCCTC-BHQ1-3′及YH-1TaqMan探針5′-CCACGCCTGTAATCCCAGC-BHQ1-3′。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成，TaqMan探針由通用生物系統(安徽)有限公司合成。YH-1經NCBI Blast比對結果顯示，其拷貝數為300，全長為200 bp。

1.2.4 質粒標準品的制備

將外源內參基因YH-1與線粒體擴增片段連接到質粒pUC57上構建質粒標準品。

1.2.5 多重熒光定量 PCR反應檢測線粒體拷貝數

多重熒光定量 PCR反應體系總體積為 20 μL，其中近岸蛋白2×ProbeMix10 μL，ROX dyeⅡ0.4 μL，引物濃度稀釋至0.5 μmol/L，加樣2 μL。探針濃度稀釋至0.05 μmol/L，加樣2 μL；標準品DNA或檢測樣本基因組DNA加樣2 μL，加超純水至20 μL。使用ABI7500 Real Time PCR System定量檢測，反應條件為94 ℃預變性5 min；循環條件為95 ℃變性15 s，58 ℃ 退火2 min，72 ℃延伸1 min，在72 ℃收集熒光信號，進行40個循環。

1.3 試驗數據分析

1.3.1 標準曲線的建立

利用ABI軟件標準曲線建立功能，自動生成標準曲線。

1.3.2 線粒體拷貝數計算

應用絕對定量法計算線粒體DNA的拷貝數，如式(1)所示。

線粒體DNA拷貝數=300/2-ΔΔCt

式中：ΔΔCt=(Ct線粒體-Ct核)樣品-(Ct線粒體-Ct核)質粒，Ct為實時熒光定量PCR過程中擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環數; 300為內參基因YH-1的拷貝數。

1.3.3 統計學分析

使用GraphPad prism 5.0 軟件進行數據統計學分析和繪圖。

1.4 應用

對100例血液樣本(男性、女性各50例，分為5個年齡組20～30、31～40、41～50、51～60、61～70歲，每個年齡組男性、女性各10例)通過瓊脂糖包塊法提取基因組DNA來檢測線粒體拷貝數。

2 結果分析

2.1 高拷貝內參基因在人群中拷貝數穩定

為獲得可靠、準確的檢測結果，要求內參基因在人群中穩定且沒有拷貝數差異。從基因組數據庫中篩選出的一段200 bp的基因組片段(300拷貝)作為新的內參基因命名為YH-1，以100例人血液DNA樣本為模板進行多重熒光定量 PCR擴增，利用單拷貝內參基因36B4驗證該內參基因的穩定性。試驗結果表明：YH-1基因在人群中拷貝數穩定(見圖1)，兩基因Ct值相差8.36，數值上符合拷貝數倍數差異；并且YH-1基因在男性和女性樣本中與內參基因的差值(ΔCt)趨于相近。由此證明內參基因YH-1在X染色體上沒有非特異性擴增(見圖2)，可以作為穩定的內參基因。

圖1 利用內參基因36B4驗證YH-1基因在人群中穩定性

圖2 YH-1基因在性染色體(X染色體)上擴增情況

2.2 多重熒光定量PCR檢測線粒體的標準曲線建立

5個濃度梯度線粒體樣品Ct值與樣本質量的標準曲線如圖3所示。由圖3可知，線粒體Ct值與其質量呈較好的線性關系(r2=0.995)，且擴增效率為111.155%。標準曲線的線性回歸方程為y=-3.081×lgx+23.677，其中，y為Ct值，x為線粒體標準品的質量，ng。

圖3 多重熒光定量PCR檢測線粒體拷貝數的標準曲線

2.3 細胞總DNA抽提方案比較

使用多重熒光定量PCR法檢測樣本線粒體DNA拷貝數，結果如表1所示。由表1可知：瓊脂糖包塊法能夠高效抽提出樣本總DNA，試劑盒法、磁珠方法次之，酚-氯仿抽提方案的效率最低；利用瓊脂糖包塊法抽提的樣本線粒體DNA拷貝數最多，提示該方法抽提線粒體DNA得率最高。

表1 不同方案抽提基因組DNA結果

2.4 樣本檢測

利用本文方案測定了100名20～70歲受試者的血細胞中線粒體DNA的拷貝數，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著年齡的增長，線粒體拷貝數呈降低趨勢。在40歲之前，男性和女性的線粒體DNA拷貝數隨年齡變化沒有明顯的變化趨勢；40歲之后，線粒體DNA拷貝數隨年齡增長呈明顯下降，并且，女性線粒體拷貝數在同年齡段中稍高于男性。

圖4 線粒體DNA拷貝數與年齡的關系

3 結 語

本文設計了一種新型多重熒光定量PCR檢測線粒體DNA拷貝數的方案，該方案首次選用穩定的多拷貝基因為內參，同時消除了檢測內參基因與目的基因時的孔間差。試驗結果表明，該檢測技術簡單易行、結果可靠，簡化檢測步驟以及節約樣本，適用于群體樣本檢測。利用該方案檢測了100例20～70歲受試者的血細胞中線粒體DNA的拷貝數，發現線粒體DNA拷貝數與年齡增長呈負相關。另外，不同的總DNA提取方法對線粒體DNA的得率也不同。研究發現，瓊脂糖包塊法抽提樣本總DNA效果最好，更適用于后續線粒體DNA拷貝數檢測研究。總而言之，更加精準的線粒體拷貝數檢測方法能夠揭示線粒體拷貝數變化與衰老和疾病的關系，本文方法將為科研工作者提供一種更加可靠、方便的試驗方案。