阿帕替尼對結腸癌細胞侵襲能力的影響及其分子機制

朱棟良 黎尉浩 嚴海東 尹小平 田曉玲

目前,針對結腸癌的主要治療方案仍是以手術切除為主的綜合治療，晚期結腸癌、伴有遠處轉移或術后復發的結腸癌預后較差。以氟尿嘧啶及奧沙利鉑為主的化療藥物能夠一定程度上抑制腫瘤的生長，但效果有限，伊立替康及靶向藥物西妥昔單抗等藥物對于高轉移性的結腸癌可以緩解疾病的進展，但較大的不良反應及靶向藥物的耐藥限制了其臨床應用。目前，亟待開發新的更有效的靶向藥物[1-2]。阿帕替尼(apatinib)是血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)特異性小分子抑制劑，后者作為腫瘤內血管生成的關鍵調控因子，在腫瘤的侵襲轉移中發揮重要作用[3-4]。我們以人結腸癌細胞SW480作為研究對象，研究阿帕替尼對于結腸癌侵襲能力的影響。

材料和方法

一、細胞及試劑

SW480人結腸癌細胞購自上海中科院生物研究所。實驗用阿帕替尼由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司贈予。胎牛血清、DMEM培養基購自武漢啟動子生物有限公司。抗E-cadherin抗體(CST,No.3195)，抗Vimentin抗體(CST,No.5741),抗Snail抗體(CST,No.3879)，抗Slug抗體(CST,No.9585)及抗內參GAPDH抗體(CST,No.5174)，預鋪好Matrigel的Transwell(8um孔徑)等其他耗材均購自美國康寧公司。

二、方法

1.細胞培養：SW480細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2溫箱內培養，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.細胞存活能力實驗：不同濃度阿帕替尼處理后的SW480細胞，分別于0小時、48小時按照CCK-8試劑盒說明書，每孔加入10%的CCK8溶液，繼續孵育4小時后，利用酶標儀在492 nM測定吸光度并繪制曲線，每組設5個復孔，實驗重復3次。

3.細胞侵襲能力實驗：將培養至對數生長的SW480細胞，用無血清DMEM培養基重懸，以每孔5×104的密度加入到預鋪好Matrigel的Transwell小室上室內，下室加入600 ml完全培養液，分別加入阿帕替尼使其終濃度為60 nM、120 nM或陰性對照，培養箱中常規培養48小時取出上室，用4%多聚甲醛后0.01%結晶紫染色，200倍光學顯微鏡下計數穿膜細胞數，隨即取5個視野，取平均值，每組實驗設3個復孔，實驗重復3次。

4.免疫印跡(Western blot)：檢測120 nM阿帕替尼處理后SW480細胞中E-cadherin、Vimentin、Snail及Slug等MET相關蛋白水平的變化。收集細胞，加入適量NP-40裂解獲取細胞總蛋白液，加入適量SDS上樣緩沖液100 ℃水浴解交聯。蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結合，然后依次孵育一抗及二抗后ECL顯色液顯影，以GAPDH作為內參。

三、統計學方法

結果

1.阿帕替尼對SW480細胞存活能力的影響：在SW480細胞中加入不同濃度的阿帕替尼，觀察其對細胞活性的影響，通過CCK8試劑盒檢測細胞在492 nm波長下的吸光度。結果提示，當阿帕替尼的濃度≤120 nM時對SW480細胞的存活沒有顯著影響，而當阿帕替尼濃度≥180 nM時，對SW480細胞的存活有明顯的抑制作用。本研究觀察阿帕替尼對腫瘤細胞侵襲能力的影響，因此后文中主要選擇60 nM及120 nM的阿帕替尼作為工具，以排除阿帕替尼對細胞增殖、生長的影響(圖1)。

aP<0.05 vs Blank,bP<0.05 vs Vector,n=5

2.阿帕替尼對SW480侵襲能力的影響：觀察60 nM及120 nM的阿帕替尼及陰性對照(Vector)處理48小時后的SW480細胞，計數穿過Matrigel的細胞數目以代表細胞的侵襲能力。結果提示，120 nM阿帕替尼處理后的穿膜細胞數為(34±7)個/視野，60 nM阿帕替尼處理后的穿膜細胞數為(46±6)個/視野，相比于陰性對照組(Vector)的(109±6)個/視野及空白對照組(Blank)的(112±4)個/視野顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 apatinib對SW480細胞侵襲能力的影響(龍膽紫染色×200)

3.阿帕替尼對MET相關蛋白表達的影響：將上述細胞裂解提取總蛋白后行Western blot檢測發現，120 nM阿帕替尼處理后，SW480細胞中上皮性標志E-cadherin的蛋白表達明顯升高，相對應的是間質性標志Vimentin的表達明顯減少；同時檢測了與MET相關的轉錄因子的表達，其中Snail、Slug的表達明顯降低(圖3)。

圖3 apatinib對SW480中MET相關蛋白的影響

討論

VEGF是一種重要的細胞因子，可由腫瘤細胞或腫瘤間質細胞所分泌，其作用于腫瘤細胞表面的VEGFR，可直接促進腫瘤細胞的增殖和生長，而作用于腫瘤中的間質細胞如血管內皮細胞，則可促進后者的增殖，而增強腫瘤的血管生成[5]。VEGF及VEGFR是目前公認的腫瘤分子靶向治療的重要靶點。目前，針對于VEGF及VEGFR的靶向藥物包括VEGF的單克隆抗體如貝伐單抗、VEGFR的單克隆抗體如雷莫蘆單抗，以及本文所研究的針對VEGFR的酪氨酸激酶小分子抑制劑如阿帕替尼[5]。阿帕替尼目前已批準用于二線化療藥物無效及伴有遠處轉移的進展期胃癌的臨床治療，而在結腸癌、乳腺癌等其他上皮來源腫瘤中的研究正處于臨床試驗階段。阿帕替尼主要作用于VEGFR2，后者是介導腫瘤血管生成的關鍵受體亞型，因此阿帕替尼延長晚期腫瘤病人生存期、改善生活質量的分子機制在于抑制腫瘤的血管生成[3-4]。而EMT及與其反向的MET是腫瘤轉移的重要分子機制之一[6-7]，阿帕替尼是否能夠影響腫瘤的EMT或MET過程，進而抑制腫瘤的侵襲轉移尚不清楚。本文研究低劑量阿帕替尼對于結腸癌細胞侵襲能力的影響。

我們在結腸癌細胞株SW480中，加入不同濃度的阿帕替尼，觀察到當阿帕替尼濃度≤120 nM時，阿帕替尼對SW480細胞的生長存活能力沒有顯著影響。我們通過預鋪好Matrigel的Transwell小室模擬腫瘤轉移時需要穿透的組織細胞基底膜，觀察到阿帕替尼可減少SW480細胞的穿膜個數，即阿帕替尼抑制了SW480細胞的侵襲能力。我們發現，SW480細胞經阿帕替尼作用后細胞從長梭形變成橢圓形，偽足減少變短，細胞間隙也相應變小，而這些形態學改變是MET的特征表現。EMT及與其反向的MET作為一種復雜而且重要的生物學效應，廣泛參與到多種病理生理進程，其中包括惡性腫瘤的侵襲轉移[5-6]。阿帕替尼使細胞從轉移能力較強的間質表型向轉移能力較弱的上皮表型轉化，從側面解釋阿帕替尼對SW480細胞侵襲能力的抑制作用。為了證實阿帕替尼通過使細胞發生MET從而抑制細胞的侵襲能力，我們利用Western blot檢測阿帕替尼對細胞中MET相關蛋白如E-cadherin、Vimentin等蛋白水平的影響，結果發現，上皮標志E-cadherin表達升高，間質標志Vimentin表達降低，而作為調控MET的重要轉錄因子的Snail及Slug的表達也下降，提示阿帕替尼可能通過調控Snail、Slug抑制結腸癌細胞的侵襲轉移。

綜上所述，阿帕替尼可抑制結腸癌細胞株SW480發生MET，從而降低其侵襲轉移的能力，阿帕替尼處理后SW480細胞中MET相關轉錄因子Snail、Slug的表達下降，提示Snail、Slug可能參與阿帕替尼介導的MET變化過程中。但阿帕替尼調控Snail、Slug的具體分子學機制尚待闡明。本研究提示，阿帕替尼可能參與結腸癌的發生發展。