二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)血管外周脂肪細(xì)胞的累積抑制腹主動(dòng)脈瘤的形成*

田 麗，張瑾瑾，楊 柳，劉 肖，葉春芳，孟憲杰，李 會(huì)，張麗華，趙永波，馬 冬△

(1.河北省唐山市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 063001；2.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山 063210;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院心外科，石家莊 050000)

腹主動(dòng)脈瘤(AAA)導(dǎo)致的主動(dòng)脈破裂是老年人群中死亡的常見(jiàn)病因[1]，其主要病理學(xué)特征是血管系統(tǒng)炎癥和主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的病理性重塑，與年齡、性別、遺傳、吸煙、肥胖、血脂異常和高血壓等因素具有明顯的正相關(guān)關(guān)系[2]。目前臨床上尚無(wú)有效控制AAA進(jìn)展或?qū)⑵淠孓D(zhuǎn)的藥物。血管外周脂肪組織具有較強(qiáng)應(yīng)答高脂飲食帶來(lái)的脂肪異位沉積，促進(jìn)血管外周脂肪細(xì)胞(PAs)堆積、炎癥產(chǎn)生和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[3]，提示PAs的累積在AAA發(fā)生中具有重要作用。DODERER等[4]研究發(fā)現(xiàn)，AAA外膜存在大量的脂肪細(xì)胞蓄積，并且證實(shí)了這些PAs促使AAA形成是一個(gè)新穎的病理生理機(jī)制。

二甲雙胍(Met)作為治療2型糖尿病的一線藥物，研究證實(shí)其不僅具有降糖作用，還包括減少系統(tǒng)炎癥和氧化應(yīng)激，以及抑制細(xì)胞外基質(zhì)重塑等功能[5]。有研究對(duì)合并糖尿病的AAA患者的用藥進(jìn)行邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)，只有Met的使用與AAA的擴(kuò)張呈負(fù)相關(guān)，提示Met可能對(duì)AAA的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用，但其具體機(jī)制尚不明確[6-7]。另外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)脂滴相關(guān)蛋白(HILPDA)分別在糖尿病和AAA患者血管組織中表達(dá)明顯升高，且有研究報(bào)道顯示，該蛋白作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的靶點(diǎn)參與脂肪積累、脂滴形成、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[8-9]。因此，本課題組擬從Met對(duì)AAA形成影響的角度探討其具體分子機(jī)制，油紅染色觀察PAs的累積，采用免疫熒光染色、Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)脂滴形成、HILPDA和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，探討其作用機(jī)制，為有效抗炎治療AAA提供分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

Osmotic Pump緩釋泵購(gòu)自明陽(yáng)科華生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)購(gòu)于北京Solarbio公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、總蛋白提取試劑盒、高脂飼料(含0.15%膽固醇、21%脂肪)購(gòu)自江蘇美迪森公司；4%多聚甲醛溶液購(gòu)自北京雷根生物有限公司；10%山羊血清購(gòu)自上海碧云天公司；anti-HILPDA抗體購(gòu)自上海LSBio公司；FITC標(biāo)記的熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Therno Fisher Scientitic公司；抗熒光淬滅封片液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1AAA模型建立與分組干預(yù)

10只8～10周齡ApoE-/-雄性小鼠購(gòu)自北京維通利華技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物房，體重(27.0±1.2)g。小鼠皮下植入加AngⅡ的緩釋泵以1 000 ng·kg-1·min-1的釋放速度持續(xù)28 d并高脂飼養(yǎng)構(gòu)建小鼠AAA模型，均分為兩組：AAA組和Met組,Met組通過(guò)飲水?dāng)z入Met(250 mg/kg)，每天1次。4周后水合氯醛麻醉取材，測(cè)量腹主動(dòng)脈擴(kuò)張尺寸，并采用油紅O染色觀察血管外周脂肪組織累積情況。一部分動(dòng)脈置于4%多聚甲醛中固定不少于24 h，組織脫水透明，石蠟包埋，制作病理切片并進(jìn)行烤片；另一部分置于液氮中，用于基因的表達(dá)分析。

1.2.2油紅O脂肪染色法

按照北京Solarbio公司油紅染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將新取下的完整小鼠主動(dòng)脈組織，采用0.5%的油紅O溶液孵育7～8 min，棄液體，PBS洗5遍，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3免疫熒光染色

石蠟包埋組織，4 μm切片，脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸修復(fù)液高壓抗原修復(fù)，冷卻后PBS洗3遍，10%山羊血清孵育30 min；傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗?jié)窈兄? ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，熒光二抗室溫孵育，PBS避光沖洗，抗熒光淬滅劑避光封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。

1.2.4Western blot檢測(cè)

取出凍存的血管組織，置冰上充分研磨后加入組織裂解液，4 ℃離心提取蛋白；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉中封閉，一抗4 ℃過(guò)夜，PBS洗膜，二抗孵育，再PBS洗膜，滴加ECL發(fā)光液，機(jī)器曝光顯影。

1.2.5qPCR

取出凍存的血管組織，Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用StepOnePlus Real-Time PCR System檢測(cè)基因腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6的轉(zhuǎn)錄水平，2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因的表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠瘤體直徑和PAs累積比較

通過(guò)對(duì)兩組小鼠主動(dòng)脈樣本的外徑測(cè)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與AAA組比較，Met組小鼠的瘤體直徑減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.98±0.05)mmvs.(2.37±0.09)mm,P<0.01]；同時(shí)，油紅O染色發(fā)現(xiàn)Met組小鼠的瘤體PAs累積較AAA組明顯減少，見(jiàn)圖1。

2.2 免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)兩組PAs中脂滴形成和HILPDA的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AAA組比較，Met組PAs中脂滴形成減少，Met組HILPDA染色(紅色)較淺；Western blot進(jìn)一步證實(shí)Met組HILPDA表達(dá)較AAA組減少，見(jiàn)圖2。

A:油紅染色(×5)，紅色部分代表小鼠主動(dòng)脈外周脂肪組織油紅O染色結(jié)果，方框標(biāo)注部分表示瘤體部位；B：瘤體直徑測(cè)量統(tǒng)計(jì)圖；a：P<0.01。

A:免疫熒光染色檢測(cè)(×630)，紅色染色代表HILPDA表達(dá)，藍(lán)色代表細(xì)胞核染色；B:Western blot；a：P<0.01,與AAA組比較。

2.3 qPCR檢測(cè)兩組小鼠瘤體組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)

qPCR檢測(cè)兩組小鼠瘤體外周脂肪組織中炎癥因子的表達(dá)結(jié)果顯示，與AAA組比較，Met組小鼠瘤體組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平降低(分別降低0.56倍、0.33倍和0.74倍)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)，見(jiàn)圖3。

a:P<0.05;b:P<0.01。

3 討 論

AAA是血管外科最危險(xiǎn)的疾病之一，血管細(xì)胞外基質(zhì)改變、炎性反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等參與其發(fā)病機(jī)制[10]。本研究采用AngⅡ灌注和高脂飲食誘導(dǎo)AAA小鼠模型證實(shí)了Met干預(yù)抑制AAA的作用，油紅O染色發(fā)現(xiàn)Met組小鼠瘤體外周PAs累積顯著減少；免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Met處理導(dǎo)致PAs脂滴形成減少和HILPDA表達(dá)水平降低，以及qPCR證實(shí)PAs中炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表達(dá)水平同樣明顯降低，說(shuō)明Met抑制AAA的作用與減少HILPDA表達(dá)及其介導(dǎo)的PAs脂滴形成，抑制血管外周脂肪組織增加帶來(lái)的炎癥環(huán)境相關(guān)。肥胖作為心血管疾病發(fā)病的主要因素之一，有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖期間血管周?chē)窘M織表現(xiàn)出活動(dòng)性局部炎癥，會(huì)增加主動(dòng)脈瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[11]，而Met可抑制多種代謝性疾病相關(guān)的炎性因子[12]，并且可以明顯抑制脂肪細(xì)胞的成脂分化[13]，說(shuō)明本研究結(jié)果與以往報(bào)道一致，證實(shí)了以上結(jié)論。另外，臨床上AAA患者M(jìn)et用藥隊(duì)列研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者采用Met治療可顯著降低AAA的膨脹速率[14]，提示本研究結(jié)論可能是其作用機(jī)制之一。

近年來(lái)有關(guān)Met抑制動(dòng)脈瘤相關(guān)的機(jī)制研究主要是針對(duì)血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行的，如WANG等[15]報(bào)道了Met抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AAA是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑發(fā)揮抗AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和自噬的作用；LI等[16]研究發(fā)現(xiàn)Met具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換和炎癥因子分泌并抑制腦動(dòng)脈瘤的作用，其分子機(jī)制是通過(guò)激活A(yù)MPK/ACC信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)Met抑制AAA瘤體外周PAs的累積，進(jìn)而抑制血管炎癥和AAA的形成是從另一個(gè)角度詮釋AAA的病理生理學(xué)機(jī)制，提示Met在多類(lèi)型細(xì)胞中發(fā)揮抑制AAA形成和進(jìn)展的作用。

值得注意的是，盡管在動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí)了炎癥和蛋白降解機(jī)制的干預(yù)可以有效抑制AAA的形成和發(fā)展，但是目前臨床研究結(jié)果均以失敗告終，甚至某些炎癥干預(yù)措施會(huì)促使AAA的發(fā)展或者加速血管的破裂[17]。新近研究報(bào)道巨噬細(xì)胞中HILPDA表達(dá)的抑制能夠增強(qiáng)甘油三酯的脂解作用，減少脂滴形成[18]，但并沒(méi)有抑制脂肪組織中的炎癥水平，提示HILPDA作為分子治療靶點(diǎn)要考慮其組織細(xì)胞特異性，在巨噬細(xì)胞中抑制其表達(dá)對(duì)血管外周脂肪組織炎癥減少可能同樣沒(méi)有意義；與此相反，本研究結(jié)果表明在血管外周PAs中抑制HILPDA的表達(dá)卻能夠發(fā)揮重要的抗炎作用(減少脂肪組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá))，提示脂肪組織中HILPDA表達(dá)的抑制影響血管外周炎癥環(huán)境的分子機(jī)制研究將是重要方向。

綜上所述，Met通過(guò)抑制PAs中HILPDA的表達(dá)、減少脂滴的形成、脂肪細(xì)胞增殖及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑制AAA的作用，HILPDA可能是一個(gè)新穎的分子治療靶點(diǎn)。