右美托咪定對(duì)氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧下Huvecs的保護(hù)機(jī)制*

姚浩旗，汪惠文，王公孝，楊天德，陳 建

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院麻醉科,蘭州 730050；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科 401120；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系，重慶400038)

右美托咪定(DEX)是高選擇性的α2 受體激動(dòng)劑[1]，近期研究發(fā)現(xiàn)其有減輕器官缺血再灌注損傷的作用[2-3]。而本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DEX預(yù)處理可以減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Huvecs)在氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧條件下的損傷[4]，但具體的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步深究。為此本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上探究DEX預(yù)處理對(duì)Huvecs的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株Huvecs(由陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系贈(zèng))復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞約80%融合時(shí)，用0.05%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑藥物

DEX：江蘇恒瑞制藥有限公司；高糖培養(yǎng)基 (DMEM)、胎牛血清：美國(guó)Gibico公司；α2 受體激動(dòng)劑抑制劑育亨賓(YHB)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山羊抗兔IgG：上海碧云天生物科技公司。β-actin：上海貝博生物，BB-2101;AMP依賴的蛋白激酶α(AMPKα)、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)一抗：德國(guó)CST公司。Seahorse能量分析試驗(yàn)材料：海馬生物科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Themofisher Scientific公司)；Seahorse細(xì)胞能量代謝實(shí)時(shí)測(cè)定儀(美國(guó)Agilent公司)；電泳儀、全自動(dòng)酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光曝光儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4 分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后接種于直徑3.5 cm培養(yǎng)皿或 Seahorse檢測(cè)板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分2部分，氧糖剝奪前細(xì)胞分3組：對(duì)照組(NC組)、DEX組、DEX+YHB組。DEX+YHB組加入50 μmol/L的DEX和100 μmol/L YHB處理細(xì)胞2 h，DEX組加入50 μmol/L的DEX處理細(xì)胞2 h。氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧后細(xì)胞分4組：對(duì)照組(NC組)、ogd/r組、DEX+ogd/r組、DEX+YHB+ogd/r組。DEX+ogd/r組加入50 μmol/L的DEX預(yù)處理2 h，DEX+YHB+ogd/r組加入50 μmol/L的DEX和100 μmol/L YHB處理2 h，ogd/r組加入等體積的PBS，隨后將3組細(xì)胞置于Hank′s液中于缺氧恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，之后換正常培養(yǎng)基置于常氧恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，NC組置于正常條件下培養(yǎng)18 h。

1.5 Western blot檢測(cè)氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧處理前、后各組AMPKα磷酸化水平

每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，實(shí)驗(yàn)處理后提取各組細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞線粒體呼吸功能的Seahorse檢測(cè)

每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，接種于Seahorse檢測(cè)板中，進(jìn)行線粒體呼吸功能檢測(cè)，具體方法參考胡洸瑜等[5]研究。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DEX提高常氧條件下Huvecs AMPKα磷酸化水平

用Western blot檢測(cè)氧糖剝奪前Huvecs p-AMPKα水平。與NC組相比，DEX組AMPKα磷酸化水平升高(NC組：2.762 5±0.929 0；DEX組：4.542 6±0.718 5；n=3，P<0.05)；與DEX組相比，DEX+YHB組AMPKα磷酸水平降低(DEX組：4.542 6±0.718 5；DEX+YHB組：2.827 7±0.054 5；n=3，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 DEX提高常氧條件下Huvecs AMPKα磷酸化水平

2.2 DEX預(yù)處理提高Huvecs常氧條件下線粒體呼吸功能

通過(guò)Seahorse 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組線粒體的呼吸能力。與NC組相比，DEX組線粒體基礎(chǔ)氧氣消耗速率、三磷酸腺苷(ATP)生成水平和最大氧氣消耗速率升高(NC組：60.770 2±11.393 8、36.806 8±6.127 1、95.914 3±17.298 9；DEX組：78.780 7±19.516 3、48.533 1±14.164 3、128.474 5±9.469 5；n=5，P<0.05)；與DEX組相比，DEX+YHB組Huvecs線粒體基礎(chǔ)氧氣消耗速率、ATP生成水平和最大氧氣消耗速率均下降(DEX組：78.780 7±19.516 3、48.533 1±14.164 3、128.474 5±9.469 5；DEX+YHB組：72.629 6±8.288 1、42.727 9±10.884 8、114.085 0±10.886 5；n=5，P<0.05)，見(jiàn)圖2～4。

圖2 DEX預(yù)處理提高Huvecs的最大呼吸速率

圖3 DEX預(yù)處理提高Huvecs的基礎(chǔ)呼吸速率

2.3 各組AMPKα分子的磷酸化水平

與NC組相比，12 h的氧糖剝奪，4 h的再?gòu)?fù)氧可以使Huvecs內(nèi)部p-AMPKα水平升高(NC組：10.503 9±2.479 6，ogd/r組：16.216 9±0.883 2，n=3，P<0.05)；與ogd/r組相比，DEX+ogd/r組AMPKα水平顯著升高(ogd/r組：16.216 9±0.883 2，DEX+ogd/r組：33.435 7±8.866 6，n=3，P<0.05)；與DEX+ogd/r組相比，DEX+YHB+ogd/r組p-AMPKα水平降低(DEX+ogd/r組：33.435 7±8.866 6，DEX+YHB+ogd/r組：21.729 6±7.406 5，n=3，P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖4 DEX預(yù)處理提高Huvecs ATP的生成水平

圖5 DEX提高氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧條件下Huvecs AMPKα 磷酸化水平

3 討 論

目前的研究證實(shí)DEX預(yù)處理對(duì)Huvecs具有保護(hù)作用[4]，而在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEX可以激活A(yù)MPK發(fā)揮其在心肌缺血再灌注損傷中的抗氧化應(yīng)激作用[6]，本研究在這些研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了其對(duì)Huvecs的保護(hù)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于ogd/r組來(lái)說(shuō)，DEX+ogd/r組Huvecs的p-AMPKα水平上升；相對(duì)于DEX+ogd/r組來(lái)說(shuō)，DEX+YHB+ogd/r組p-AMPKα水平降低，這說(shuō)明DEX預(yù)處可能通過(guò)激活A(yù)MPKα發(fā)揮其對(duì)Huvecs的保護(hù)作用，而該作用可以被YHB拮抗。本研究發(fā)現(xiàn)在氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧前給予DEX預(yù)處理2 h既能明顯提高p-AMPKα水平，而YHB使DEX的效應(yīng)有所逆轉(zhuǎn)。近期有研究發(fā)現(xiàn)DEX對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與AMPKα依賴的自噬有關(guān)[7]，DEX也有可能通過(guò)自噬發(fā)揮對(duì)Huvecs的保護(hù)作用，這個(gè)推論需要進(jìn)一步證實(shí)。AMPKα分子被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)部能量與代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子之一，其在糖尿病、高脂血癥、肥胖癥等多種與代謝相關(guān)的疾病中均有重要作用[8]。 在大鼠糖尿病模型中，DEX可以通過(guò)激活A(yù)MPKα減輕氧化應(yīng)激損傷[9]，同時(shí)在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的Huvecs損傷模型中，AMPKα分子的激活對(duì)Huvecs有保護(hù)作用[10-11]，而缺氧復(fù)氧過(guò)程中氧化應(yīng)激也是細(xì)胞損傷的主要機(jī)制之一。據(jù)此，作者推論:DEX通過(guò)激活A(yù)MPKα減輕氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧時(shí)Huvecs的氧化應(yīng)激損傷，而其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和死亡形式的影響，需要進(jìn)一步探究。

DEX作為一種麻醉輔助藥，能顯著降低全麻手術(shù)患者應(yīng)激和炎性反應(yīng)水平，有助于改善患者的臨床療效[12],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)如在膿毒癥小鼠身上也證實(shí)其有抗炎作用[13]，而血管內(nèi)皮細(xì)胞作為組織與血液的第一屏障，其在機(jī)體應(yīng)激和炎癥等病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞也許是DEX發(fā)揮圍術(shù)期器官保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一。現(xiàn)有研究證實(shí)AMPKα不僅對(duì)缺氧復(fù)氧條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能有影響，并且參與了Huvecs炎性反應(yīng)[14]；據(jù)此認(rèn)為DEX可能會(huì)通過(guò)AMPKα分子發(fā)揮其對(duì)Huvecs的抗炎作用，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這個(gè)猜想并尋找該通路的下游靶分子。

AMPKα分子被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)部能量與代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子之一，該分子的激活可以提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，抑制蛋白質(zhì)、糖原和脂類的合成，促進(jìn)糖類有氧氧化和脂類的分解代謝，從而為細(xì)胞提供更多能量[15]。現(xiàn)有研究認(rèn)為DEX可以提高293細(xì)胞的線粒體呼吸功能[16]，據(jù)此推測(cè)DEX可能是通過(guò)激活該分子改善了Huvecs的內(nèi)部能量代謝，所以本研究還進(jìn)行了線粒體呼吸功能檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于NC組來(lái)說(shuō)，50 mol/L DEX明顯提高了線粒體的有氧呼吸能力，同樣用α2腎上腺素受體的拮抗劑YHB之后，該作用被削弱。

綜上所述，DEX在提高了p-AMPKα水平后，會(huì)進(jìn)一步影響線粒體的生物合成能力，線粒體的氧氣消耗速率間接地反映了線粒體的有氧氧化水平和生物合成能力。在氧糖剝奪條件下，細(xì)胞是處于一種無(wú)氧無(wú)能量來(lái)源的狀態(tài)，此時(shí)的細(xì)胞要適應(yīng)這種極端環(huán)境需要一定的能量?jī)?chǔ)備。在本研究中發(fā)現(xiàn)DEX預(yù)處理可以提高線粒體的有氧呼吸能力，使細(xì)胞在氧糖剝奪處理前細(xì)胞內(nèi)部能量?jī)?chǔ)備量升高，以滿足Huvecs在氧糖剝奪狀態(tài)下的能量需求。結(jié)合本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：DEX預(yù)處理通過(guò)激活α2受體提高p-AMPKα水平，p-AMPKα可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，促進(jìn)生成能量的生物化學(xué)反應(yīng)，抑制消耗能量的物質(zhì)合成反應(yīng)，提高線粒體的呼吸功能，增加細(xì)胞內(nèi)部能量?jī)?chǔ)備，這有利于Huvecs細(xì)胞適應(yīng)氧糖剝奪的極端環(huán)境，利于細(xì)胞的生存，減輕細(xì)胞損傷，而DEX對(duì)Huvecs的通透性和死亡形式及炎性反應(yīng)的影響，需要進(jìn)一步探索。