玉米穗腐病病原菌新知鐮孢的鑒定及其生物學特性分析

孫華，郭寧，鄭曉娟，石潔，張立榮*，閆紅飛

（1.河北農業大學植物保護學院，河北省農作物病蟲害生物防治技術創新中心，河北 保定 071001；2.河北省農林科學院植物保護研究所，農業農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北省農業有害生物綜合防治工程技術研究中心，河北 保定 071000）

玉米是我國主要糧食作物，也是重要的飼料作物及工業原料，在我國農業生產和國民經濟發展中占有重要地位。玉米穗腐病是玉米生長后期的侵染性病害，在世界各玉米產區均有發生，田間損失率一般為5%～10%，嚴重者可達50%以上[1]。該病害不僅造成玉米的產量損失，其病原菌產生的毒素等次級代謝產物還嚴重影響玉米的質量，食用被真菌毒素污染的玉米可危害人和牲畜的健康，甚至會造成死亡。

目前已報道的引起玉米穗腐病的病原菌種類有40余種[2]，包括鐮孢菌屬（Fusariumspp.）、青霉屬（Penicilliumspp.）、木霉屬（Trichodermaspp.）和曲霉屬（Aspergillusspp.）等，其中鐮孢菌屬為主要病原菌[3]。鐮孢菌屬的分類和鑒定較為困難，僅僅依靠形態學特征不能準確鑒定到種，需要結合分子生物學方法。用于鐮孢菌分子鑒定的基因主要有 ITS序列，以及β?tubulin、FUM、histone3和TEF?1α等基因，這些靶標基因具有較高的物種特異性[4]。多數研究表明，ITS區序列無法將鐮孢菌鑒定到種，而TEF?1α基因比較通用且可靠[5]。因此，多數研究根據病原菌小孢子、大孢子的產生及形狀，厚垣孢子的有無等形態特癥以及TEF?1α基因序列對鐮孢菌屬進行鑒定。

本團隊于2015年從采自內蒙古自治區的玉米穗腐病樣本中分離到一種鐮孢菌[6]——新知鐮孢，作為一種引起玉米穗腐病的病原菌，對其研究報道較少。本研究采用形態學與分子生物學相結合的方法對該病原菌進行鑒定，并對其致病性和生物學特性進行測定，從而明確該病原菌對不同親緣玉米品種（系）的致病力及其生活條件，以期為該病原菌引起的玉米穗腐病的流行預測及防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 供試材料 供試菌株由河北省農林科學院植物保護研究所玉米綜防實驗室保存。玉米雜交種（鄭單958、先玉335）和自交系（昌7-2、Mo17、掖478、黃早四、自330、X178、丹340和獲白）由本課題組保存，種植行長5 m，行間距60 cm，株距25 cm，每品種種植2行，3次重復。

1.1.2 試劑 真菌基因組DNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，2×EsTaqMasterMix、DNA Marker DL2000購自北京康為世紀生物科技有限公司，50×TAE購自上海生工生物工程有限公司，Biowest Agarose G-10購自南京生興生物技術有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

察氏培養基（Czapek）：NaNO33 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水定容到1 000 mL。

康乃馨培養基(CLA)[7]：將新鮮康乃馨葉片切成小片后置于干燥箱中70℃干燥3～4 h，直至葉片干燥但不失綠，在超凈工作臺中用γ-射線滅菌2 h。先在培養皿中加入2%的水瓊脂，將滅菌葉片置于水瓊脂上，待培養基凝固后再繼續加入2%的水瓊脂將葉片覆蓋。將病原菌接種到靠近葉片處。

1.1.3 主要儀器 顯微鏡（尼康ECLIPSE E100）、Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機（上海力申科學儀器有限公司）、HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）、PCR儀（東勝龍ETC-811）、DYY-11型電泳儀（北京六一儀器廠）、GelDoc XR+凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）

1.2 方法

1.2.1 病原菌鑒定 將保存的菌株接種到PDA培養基上，28℃黑暗培養6 d后觀察菌落形態、顏色，在40×顯微鏡下觀察分生孢子的有無、大小和形狀，以及厚垣孢子的有無。將CLA培養基上28℃黑暗培養5 d的病原菌在顯微鏡下觀察大孢子的有無、大小及形狀。

提取病原菌DNA，用鐮孢菌延伸因子引物TEF-F（ATGGGTAAGGARGACAAGAC）和TEF-R（GGARGTACCAGTSATCATGTT）[8]進 行 PCR 擴增。PCR反應體系25μL：DNA 1 μL、10 μmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL、TaqMix 12.5 μL，加ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序：95℃預變性10 min；95℃變性1 min，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，38個循環；72℃延伸10 min，4℃保存擴增產物。將目的片段純化后進行克隆，篩選出陽性克隆交由上海生工生物工程有限公司測序，將測序結果上傳至GenBank，利用MEGA5.2軟件，采用鄰近法（Neighbor-Joining）將測序結果與相似序列構建系統發育樹，以層出鐮孢TEF-1α序列作為外群。

1.2.2 在不同玉米雜交種和自交系上的致病性測定 將病原菌接種到PDA培養基上，28℃黑暗培養7 d，在培養皿中加入無菌水用滅菌槍頭刮下菌絲過濾，配制成1×106CFU·mL-1的孢子懸浮液。授粉3～5 d后，采用籽粒接種法[9]將孢子懸浮液注射到玉米果穗中部的籽粒上，每穗注射2 mL，以注射等量無菌水的果穗作為對照，每處理接種5個果穗，3次重復。收獲期觀察不同玉米品種（自交系）的發病情況，并對發病籽粒上病原菌進行分離、鑒定。

1.2.3 生物學特性 設置不同的碳源、氮源、溫度、pH、光照及病原菌致死溫度處理，研究它們對病原菌菌絲生長和產孢的影響。培養完成后采用十字交叉法和血球計數板法分別測量菌落直徑和產孢量，每處理重復3次。

碳源處理：分別用麥芽糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉等量置換察氏培養基中的蔗糖，將5 mm菌餅接種到不同碳源培養基上28℃黑暗培養6 d。

氮源處理：分別用牛肉膏、尿素、蛋白胨、氯化銨、酵母浸膏和硝酸銨等量置換察氏培養基中的硝酸鈉，將5 mm菌餅接種到不同氮源培養基上28℃黑暗培養6 d。

溫度處理：將病原菌接種到PDA培養基上，分別在5、10、15、20、25、30、35和40 ℃條件下黑暗培養6 d。

pH處理：用HCl或NaOH將PDA培養基的pH分別調至4、5、6、7、8、9、10、11和12，將5 mm菌餅接種到不同pH的培養基上28℃黑暗培養6 d。

光照處理：將病原菌接種到PDA培養基上，分別在連續光照、連續黑暗和12 h光照/12 h黑暗交替3種光照條件下，28℃培養6 d。

病原菌致死溫度測定：將5個5 mm菌餅和孢子懸浮液裝入離心管中，分別在 40、45、50、55、60、65、70 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min，處理過程中每隔3 min輕輕上下顛倒一次。將處理后的菌餅和孢子懸浮液轉移到PDA培養基上，28℃黑暗培養6 d。

2 結果與分析

2.1 病原菌鑒定

從圖1可以看出，該菌在PDA培養基上產生白色絮狀菌絲，培養基呈橘黃色，產生卵圓形小型分生孢子，孢子大小為（2.57～6.32）μm×（0.78～2.58）μm，在CLA培養基上產生透明狀、直形或略彎曲的大型分生孢子，有1～2個隔膜，孢子大小為（6.65～26.60）μm×（2.51～5.02）μm，無厚垣孢子，根據該菌形態特征，初步鑒定該菌為新知鐮孢（Fusariumandiyazi）。

圖1 病原菌形態特征Fig.1 Morphological characteristics of the pathogen

用TEF?1α的特異性引物擴增出1條約680 bp的條帶，GenBank登錄號為MG902915。將TEF?1α序列在NCBI上進行比對，與F.andiyazi（KT257545.1、GU827419.1、KP314282.1）的親緣關系較近，同源性達99%。利用MEGA5.2軟件，采用鄰近法構建系統發育樹，結果（圖2）表明，菌株ZBS338與F.andiyazi位于同一分支上，結合其形態學特征，確定該菌株為新知鐮孢。

圖2 菌株基于EF?1α序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains based on TEF?1α sequence

2.2 致病性測定

該病原菌對不同親緣的玉米品種（系）的致病力存在差異（圖3）。在鄭單958、獲白和昌7-2的接種部位發現籽粒腐爛，呈褐色，表面覆蓋灰白色霉層，輕微發病的籽粒表面開裂，而對照和其他品種（自交系）的果穗上均未有發病癥狀。對發病籽粒病原菌進行分離、鑒定，得到的菌株與接種菌株為同一病原菌，說明該病原菌為玉米穗腐病的致病菌且對鄭單958、獲白和昌7-2有致病性。

圖3 病原菌引起玉米穗腐病的癥狀Fig.3 Symptoms on ears inoculated with the pathogen

2.3 致病菌生物學特性分析

2.3.1 碳源、氮源對病原菌營養生長和產孢量的影響 從圖4可以看出，菌株在半乳糖為碳源的培養基上產孢量最大，為7.38×105CFU·mL-1，顯著高于其他培養基上的產孢量，表明半乳糖為該菌株產孢的最適碳源。在含蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的培養基上，病原菌菌落直徑顯著高于其他培養基，但是菌絲生長比較稀疏，在含半乳糖和可溶性淀粉的培養基上菌絲生長較致密，但是在含半乳糖培養基上病原菌菌落直徑顯著低于其他培養基。因此，經綜合分析認為可溶性淀粉為該菌株菌絲生長的最適碳源。

圖4 不同碳源、氮源對新知鐮孢營養生長和產孢量的影響Fig.4 Effect of different carbon and nitrogen sources on vegetative growth and spore numbers of F.andiyazi

菌株在7種氮源上均能生長，在含氯化銨的培養基上生長最慢，培養6 d的菌落直徑為43.33 mm；在含硝酸鈉、牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉的培養基上菌絲生長速度較快，且相互間無顯著性差異，其中酵母浸粉的產孢量最大，為67.33×105CFU·mL-1。在硝酸銨、氯化銨、酵母浸粉和蛋白胨培養基上菌絲較致密，因此，酵母浸粉為該菌的最適氮源。

2.3.2 溫度、pH對病原菌營養生長和產孢量的影響 菌株在15～35℃之間培養均能夠生長和產孢，且在30℃時菌落直徑和產孢量均達到最大值，分別為 82.00 mm和49.00×105CFU·mL-1。因此，該菌的最適生長溫度為30℃。菌株的pH適應范圍較廣，在pH 7～12時菌絲生長較快且產孢量較大，培養6 d后菌落直徑達到72.83～89.33 mm，產孢量為（25.05～33.08）×105CFU·mL-1。

2.3.3 光照對病原菌營養生長和產孢量的影響 在3種光照培養條件下菌絲生長差異不顯著，連續光照培養的產孢略高于完全黑暗和交替光照，因此，認為連續光照培養有利于該病原菌的生長。

圖5 溫度、pH對新知鐮孢營養生長和產孢量的影響Fig.5 Effect of temperature and pH on vegetative growth and spore numbers of F.andiyazi

表1 不同光照條件對新知鐮孢營養生長和產孢量的影響Table.1 Effects of different light condition on vegetative growth and spore numbers of F.andiyazi

2.3.4 病原菌的致死溫度 菌餅經40～60℃水浴處理10 min后在PDA培養基上均能生長，但經65℃及以上水浴處理10 min后不再生長，表明菌絲的致死溫度為65℃。病原菌孢子經40～70℃不同溫度處理后，在60℃及以上水浴鍋處理10 min后不能生長，表明孢子的致死溫度為60℃。

3 討論

近年來，新知鐮孢引起的各種病害不斷被報道，最早的報道是引起高粱莖腐病和穗腐病[10-11]，之后發現該病原菌可侵染水稻引起水稻惡苗病[12]，侵染甘蔗引起甘蔗枯萎病[13]。曾莉莎[14]在華南地區發現新知鐮孢侵染果樹。在墨西哥、敘利亞和中國浙江分別發現該病原菌侵染玉米果穗[15-17]。生物學特性研究結果表明，可溶性淀粉為新知鐮孢菌絲生長的最適碳源，而玉米胚乳的主要成分就是淀粉，因此可作為病原菌的主要碳源來源；該病原菌的最適氮源為酵母浸粉；最適溫度為30℃，但是在15～35℃之間均能生長，這可能就是該病原菌在我國從最北的黑龍江到最南端的海南等省（自治區、直轄市）份均有分布的原因[1,17-19]；最適pH為7～12，表明中性偏堿的環境有利于該病原菌的生長；連續光照有利于病原菌的生長；孢子的致死溫度為60℃，菌絲的致死溫度為65℃。上述結果表明，新知鐮孢對環境的適應性極強，其引起的病害應引起高度關注。

有研究報道，新知鐮孢侵染不僅造成農作物減產，還可產生伏馬毒素降低農產品品質[20]。伏馬毒素是一類鞘脂類化合物，具有易溶于水，熱穩定和不易被破壞等特點，且具有器官毒性，對雛雞心臟、肝臟、腎臟和脾臟等都有影響[21]，還具有神經毒性、免疫毒性和致癌性[22]，嚴重者可造成宿主死亡。

不同病原菌對不同玉米品種的致病性不同。本研究結果表明，新知鐮孢對鄭單958、獲白和昌7-2均有致病性，而黃早四、自330、掖478等品種未發病，這可能與接種時期、孢子懸浮液濃度或者接種方式等有關。因此關于其侵染規律需要進一步研究。但該病原菌適應性極強，將來在某些品種上存在流行的可能，且該病原菌還產生伏馬毒素，嚴重危害人畜健康，因此，還需要對影響其發生的因素進行深入研究，預防該病害的大面積流行。