加味芍甘附子湯對早期生長反應蛋白2調控膠原誘導性關節炎老年大鼠炎癥的影響

錢唐亮 張玉婷 侯秀娟 劉小平 鄭煒 康天倫 王海瑜

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性、侵襲性關節炎為主要表現的自身免疫疾病，30至50歲為其發病高峰[1]。根據發病年齡可將其分為兩類，其中青年發病并遷延至老年的RA患者稱為青壯年發病類風濕關節炎(younger onset rheumatoid arthritis，YORA)；60歲及以后發病的類風濕關節炎，稱為老年期發病類風濕關節炎(elderly onset rheumatoid arthritis，EORA)[2]。EORA相比于YORA往往發病更急，關節腫脹的臨床癥狀更加嚴重。在治療上，EORA相比于YORA對抗風濕藥物的耐藥性差，需要更多的聯合用藥[3-4]，這就增加了老年患者本已不佳的身體負擔?，F在許多臨床研究發現了中醫藥在RA治療中發揮著重要的作用[5]。本課題組前期臨床研究發現加味芍甘附子湯在改善RA患者的關節功能和生活質量方面療效確切[6]，其主要通過調節Egr2為核心的炎性通路而達到免疫調節作用[7]。在此基礎上，本實驗進一步探討加味芍甘附子湯對膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis，CIA)老年鼠早期生長反應蛋白2(early growth response protein 2，Egr2)表達及其下游炎癥因子的影響，比較EORA與YORA臨床特征差異化的內在機理，探索RA群體的治療方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雌性Wistar大鼠96只，其中青年鼠[3～4月齡，體質量(256.9±12.7)g]48只，老年鼠[12～13月齡，體質量(391.15±58.5)g]48只，均購于北京維通利華實驗動物技術公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 實驗藥物

加味芍甘附子湯：白芍15 g、制附子15 g、雞血藤15 g、甘草10 g、青風藤15 g(以上藥物由北京中醫藥大學東方醫院藥劑科統一采購)，全部藥材經煎煮、過濾、水浴蒸發至每mL藥液含生藥材1.42 g。雷公藤多苷片(湖南千金協力藥業有限公司，規格：10 mg，生產批號：6936492500053)，用蒸餾水配制為1 mg/mL。

1.3 主要儀器及試劑

牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司)；不完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；TRIZOL(Invitrogen，型號10296028)；UltraPure Agarose(ABI-invitrogen，型號16500100)；SuperScript III RT 反轉錄kit(ABI-invitrogen)；高速分散器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；臺式高速冷凍離心機(21RTHERMO)；核酸濃度測定儀(THERMO)；qPCR儀(美國Applied biosystems)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及給藥 大鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分別將老年鼠與青年鼠分成正常組、模型組、對照組、中藥組，每組各12只。正常組常規飼養，其余3組復制CIA大鼠模型后分別給予生理鹽水、雷公藤多苷片及加味芍甘附子湯灌胃4周，每日灌胃劑量：雷公藤多苷片6.25 mg/kg，加味芍甘附子湯12.5g /kg，生理鹽水0.2 mL/kg。每周評價各組大鼠關節炎癥指數(arthritis index，AI)。

1.4.2 復制CIA大鼠模型 CIA模型根據徐淑云《藥理學實驗方法》，將牛Ⅱ型膠原溶于乙酸，與等量完全弗氏佐劑溶液混合，制備牛Ⅱ型膠原終濃度2 mg/mL混合物。將上述混合物置于15 mL離心管并垂直置于冰水中，離心管置于高速分散器下，以1 000～3 000 r/分鐘攪拌2分鐘，暫停30秒冷卻，避免高速分散器轉頭攪拌過程中產熱導致蛋白變性，并反復數次使蛋白充分乳化。期間檢驗蛋白乳化情況，即用針頭挑取一滴混合物滴入水中不散，形成“油包水”狀。隨后按每只0.1 mL于大鼠左足及尾根部多點真皮內注射。壓迫注射部位使乳化物完全吸收。7天后以相同方法和相同劑量在大鼠尾根部皮內加強免疫一次。根據AI評分剔除模型不成功的大鼠。每組剔除4只，剩余8只。

1.5 檢測指標

1.5.1 AI評分 根據大鼠四肢各肢體腫脹程度及個數累計積分，以AI評分≥4分判定為模型復制成功，每周評價1次。AI評分標準如下：0分，無關節紅腫；1分，小趾關節腫脹；2分，趾關節及足跖關節腫脹；3分，踝關節以下足爪腫脹；4分，包括踝關節在內的全部足爪腫脹。AI評分最高分為16分。

1.5.2 組織病理學檢測 每組隨機選取2只大鼠，根據大鼠體質量每100 g給予0.3 mL 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剝離大鼠后肢的關節外周組織，使膝關節和踝關節充分暴露，保留好關節囊，以膝關節和踝關節為中心，用骨鉗剪斷關節上下約0.5 cm，迅速放入0.4%的甲醛中固定。后期進行免疫組化及蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色制作切片，在光學顯微鏡下進行觀察。

1.5.3 外周血白細胞介素-17A檢測 取大鼠腹主動脈血清，采用ELISA法檢測細胞因子白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、細胞因子白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)，根據試劑盒說明操作。

1.5.4 膝關節滑膜Egr2 mRNA表達情況 取膝關節滑膜組織置于液氮中保存，按照TRIzol使用說明書進行總RNA提??；按照反轉錄試劑盒說明書操作進行反轉錄；每個樣本分別用待檢測基因和內參基因引物擴增，每個反應做3個重復；統計學方法采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達量；引物均在北京Invitrogen公司合成，見表1。

表1 引物序列

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 AI評分

給藥期間，各組老年鼠AI評分均降低。給藥1周和2周時，中藥組與模型組AI評分比較差異具有統計學意義(P<0.05)。給藥3周和4周時，對照組和中藥組AI評分均低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，且中藥組AI評分低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 老年鼠各組CIA大鼠給藥期間AI評分比較

給藥期間，各組青年鼠AI評分均降低。給藥1周和2周時，對照組和中藥組AI評分均低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。給藥3周和4周時，對照組和中藥組AI評分均低于模型組(P<0.05)，且中藥組AI評分低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 青年鼠各組CIA大鼠給藥期間AI評分比較

2.2 組織病理學觀察

HE染色結果顯示，老年鼠及青年鼠正常組的踝關節組織結構和滑膜組織正常。老年鼠模型組的關節腔明顯狹窄，滑膜組織增生明顯，大量滑膜細胞增生及炎性細胞浸潤，局部壞死脫落。青年鼠模型組的關節腔可見明顯狹窄，滑膜組織明顯增厚，少量炎性細胞浸潤，局部壞死脫落。老年鼠對照組可見關節腔狹窄，滑膜組織增厚，較多滑膜細胞增生及炎性細胞浸潤。青年鼠對照組關節腔輕度狹窄，關節面光滑，滑膜組織原纖維增生，少量炎性細胞浸潤，關節面局部血管翳侵入。老年鼠中藥組關節腔未見明顯狹窄，滑膜細胞輕微增生，少量炎性細胞浸潤。青年鼠中藥組關節腔未見明顯狹窄，滑膜組織增生增厚，滑膜膠原纖維增生明顯，少量炎性細胞浸潤。見圖1～4。

注：A 正常組；B 模型組；C 對照組；D 中藥組。

注：A 正常組；B 模型組；C 對照組；D 中藥組。

注：A 正常組；B 模型組；C 對照組；D 中藥組。

注：A 正常組；B 模型組；C 對照組；D 中藥組。

2.3 滑膜組織Egr2 mRNA表達水平

與老年鼠正常組比較，老年鼠模型組、對照組、中藥組滑膜組織Egr2 mRNA的表達水平增高(P<0.05)；與老年模型組比較，老年鼠對照組和中藥組滑膜組織Egr2 mRNA的表達水平明顯增高(P<0.05)。與青年鼠正常組比較，青年鼠模型組、對照組、中藥組滑膜組織Egr2 mRNA表達水平增高(P<0.05)；與青年鼠模型組比較，青年鼠對照組滑膜組織Egr2 mRNA表達水平明顯增高(P<0.05)。老年鼠模型組滑膜組織Egr2 mRNA表達水平低于青年鼠的模型組(P<0.05)，老年鼠中藥組滑膜組織Egr2 mRNA表達水平高于青年鼠中藥組(P<0.05)。見表4。

表4 各組CIA大鼠滑膜組織Egr2 mRNA表達水平比較

2.4 外周血炎性細胞因子表達水平

與老年鼠正常組比較，老年鼠模型組外周血IL-17A、INF-γ、IL-6的表達水平增高(P<0.05)；與老年鼠模型組比較，老年鼠對照組和中藥組的外周血IL-17A的表達水平降低(P<0.05)，老年鼠對照組的外周血INF-γ、IL-6的表達水平降低(P<0.05)；與老年鼠對照組比較，老年鼠中藥組的外周血IL-17A的表達水平降低(P<0.05)。見表5。

表5 老年鼠各組CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比較

與青年鼠正常組比較，青年鼠模型組外周血IL-17A、INF-γ、IL-6的表達水平增高(P<0.05)；與青年鼠模型組比較，青年鼠對照組和中藥組外周血IL-17A、INF-γ的表達水平降低(P<0.05)，青年鼠對照組外周血IL-6的表達水平降低(P<0.05)；與青年鼠對照組比較，青年鼠中藥組外周血IL-17A的表達水平增高(P<0.05)。見表6。

表6 青年鼠各組CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比較

老年鼠與青年鼠外周血炎性細胞因子水平比較，老年鼠模型組外周血IL-17A的表達水平明顯高于青鼠模型組(P<0.05)，老年鼠對照組外周血IL-17A的表達水平明顯高于青鼠對照組，老年鼠對照組外周血IL-6的表達水平明顯低于青鼠的對照組(P<0.05)，老年鼠中藥組外周血IL-17A的表達水平明顯低于青年鼠中藥組(P<0.05)。見表7。

表7 老年鼠與青年鼠各組CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比較

3 討論

有研究表明EORA患者的血沉和C反應蛋白均高于YORA[8]，且受IL-6、IL-17A等炎性因子的影響。相比于YORA患者，EORA患者往往發病更急，且關節腫脹的臨床癥狀更加嚴重，可能與人體衰老而導致的機體炎癥相關[9]。目前關于EORA差異于YORA臨床表現的發病機理尚不明確，對該群體的特征化治療還在不斷的探索中。中醫藥治療老年類風濕關節炎提倡從整體出發，兼顧老年人脾腎虧虛、正氣不足的生理特點，靈活辨證，從而改善臨床癥狀，降低實驗室指標，達到緩解病情，改善預后的目的，臨床應用價值較高。

加味芍甘附子湯是在《傷寒論》芍甘附子湯基礎上加用藤類藥物雞血藤、青風藤，諸藥合用共奏溫經散寒、通絡止痛之功效，臨床常用于治療類風濕關節炎寒濕痹阻型的患者。多個研究小組發現寒濕痹阻證在類風濕關節炎各個證型中占首位[10-12]。本課題組前期的臨床研究發現，加味芍甘附子湯聯合傳統抗風濕藥能夠改善RA患者關節疼痛、晨僵等癥狀，改善RA疾病活動度評分和中醫證候評分，降低血沉、C反應蛋白等炎性指標，在研究過程中還發現該方不會引起患者肝腎功能異常[13]。動物實驗研究表明加味芍甘附子湯可抑制CIA老年大鼠的炎性因子IL-17A與IL-6的表達，從而對減緩其關節及肺臟組織炎癥方面有良好的效果[14]，且Egr2在CIA模型鼠的中藥中劑量組中高表達[15]，這也為本次實驗中藥劑量的選擇提供了基礎。前期的臨床研究發現加味芍甘附子湯聯合傳統抗風濕藥通過調節Egr2為核心的炎性通路而達到調節機體免疫的功效，從而抑制了炎性因子IFN-γ、IL-17A、IL-6的表達，達到抑制RA寒濕痹阻證患者的炎性反應，延緩病情的作用[16]。

本研究結果顯示，加味芍甘附子湯可降低CIA老年鼠和青年鼠的AI評分，且在4周后中藥組的評分最低，提示加味芍甘附子湯可有效減輕關節腫脹。各組大鼠組織病理學提示除正常組外，均有滑膜組織增生及炎性細胞浸潤，老年鼠模型組的炎性細胞浸潤明顯重于青年鼠模型組，且中藥組都明顯輕于模型組，提示加味芍甘附子湯可顯著抑制CIA大鼠的促炎作用，控制疾病進展。老年鼠和青年鼠滑膜組織Egr2的組內比較均顯示對照組和中藥組的表達高于模型組，說明加味芍甘附子湯和雷公藤多苷可上調滑膜組織Egr2的表達。老年鼠與青年鼠滑膜組織Egr2的組間比較顯示，老年鼠模型組的滑膜組織Egr2的表達明顯低于青年鼠模型組，而老年鼠中藥組的滑膜組織Egr2的表達明顯高于青年中藥組，說明老年鼠的發病更重可能與Egr2的低表達相關，加味芍甘附子湯可以上調Egr2的表達，且在老年鼠更加突出。老年鼠與青年鼠炎性細胞因子的組內表達顯示，老年鼠中藥組的IL-17A表達低于模型組與對照組，青年鼠中藥組的IL-17A、IFN-γ表達低于模型組，但高于對照組，說明加味芍甘附子湯可抑制CIA青年鼠和老年鼠外周血炎癥因子的表達，且對IL-17A抑制更顯著。老年鼠與青年鼠外周血炎性細胞因子的組間比較顯示，老年鼠模型組及對照組外周血IL-17A的表達均高于青年鼠，而老年鼠中藥組的表達低于青年鼠，說明加味芍甘附子湯抑制CIA老年鼠外周血IL-17A的表達比青年鼠更具優勢。

綜上所述，CIA老年鼠滑膜細胞Egr2的低表達為其參與炎癥過程的可能因素之一。Egr家族是一類能被多種刺激因素諸如缺氧、感染等誘導產生的轉錄因子?，F有的研究發現，該家族包括Egr1、Egr2、Egr3和Egr4四個成員，主要參與細胞的生長、發育、增殖以及凋亡等過程[17]。其中Egr2由T細胞受體參與誘導，是誘導T細胞失能所必需的物質[18-19]。Egr2在活化的T細胞中被高度誘導，負向調節T細胞的活化，以控制過度炎癥[20-21]?，F有的研究發現Egr2直接連接細胞因子信號傳導抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling，SOCS)1和SOCS3的啟動子，并通過誘導其活性而上調SOCS1/SOCS3的表達水平[22-24]。SOCS1/SOCS3是信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)1和STAT3活化的抑制劑，主要通過STAT1/STAT3正調控Th1與Th2細胞的分化來實現[25]，而Th1和Th17細胞可分別產生IFN-γ和IL-17，其中IL-17A是最主要的效應分子，具有較強的促炎癥作用，可誘導產生多種炎癥介質，如IL-6、IL-8等，從而引發局部或全身的炎癥反應[26]。在RA急性期IL-17A可刺激不同類型細胞分泌各種炎性細胞因子，破壞骨修復系統，導致關節腫脹變形，因此急性期的RA患者往往病情嚴重，骨侵蝕明顯[27-28]。EORA往往發病更急，更加嚴重的關節腫脹癥狀很有可能與IL-17A表達水平升高相關。加味芍甘附子湯可能通過對Egr2的調控而抑制IL-17A為主的炎性細胞的分泌，從而改善CIA老年鼠關節滑膜炎癥。本實驗樣本量小，且是對中藥治療EORA的初步探索，后期還需大量的實驗和臨床研究來驗證。