初探DNMT2基因在乳腺癌中的表達

謝濟陽 張生輝 段雯芝 張妍蓉 李云龍 何嫻婕

摘要：目的：探討DNMT2基因在乳腺癌中的表達及序列分析。方法 采用雌性 SD作為種鼠傳代腫瘤。通過Walker-256腫瘤細胞株在含10%小牛血清 1640培養液通過細胞培養技術傳代培養擴增，細胞懸液約 1.5ml（細胞數約1.0x107 ）種鼠腹腔內注射，約1周后可形成腹水瘤。測定乳腺癌組織及癌旁組織中DNMT2 mRNA 表達水平;通過免疫組化染色測定乳腺癌組織中DNMT2表達程度。結果 DNMT2 mRNA 在乳腺癌組織中的相對表達水平顯著高于乳腺癌旁組織（P< 0.05）。乳腺癌組織中DNMT2表達程度及陽性表達率顯著增加。結論 DNMT2在乳腺癌組織中有表達，與乳腺癌的發生發展有一定的相關性。

關鍵詞：DNMT2;乳腺癌;中老年

女性全年齡段惡性腫瘤中乳腺癌發病率排在首位，且發病率呈逐漸升高和發病年齡逐漸年輕化的趨勢[1]。目前研究結果表明在乳腺癌的發生發展過程中抑癌基因的高甲基化和癌基因的低甲基化起到非常重要的作用，并且這種異常的甲基化和機體內DNMTs表達水平的變化就是導致這種異常甲基化治病的機制之一[2]。甲基化在機體內的修飾是在DNMTs作用下形成mC的過程，所以理論上來講甲基化應該與DNMT的活性有關。本文就是采用實時熒光定量PCR技術檢測乳腺癌組織以及對應的乳腺癌旁組織中DNMT2 基因相對表達水平及與臨床病理特征之間的關系。

1材料和方法

1.1實驗動物

雌性 SD（Sprague-Dawley）小鼠 45只，體重 200±l0g。另 SD 小鼠 12只，體重 50～60g，雌雄不限，作為種鼠傳代腫瘤。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳腺癌模型制作

Walker-256腫瘤細胞株在含 10%小牛血清 1640培養液通過細胞培養技術傳代培養擴增，細胞懸液約 1.5ml（細胞數約1.0x107 ）種鼠腹腔內注射，約 1周后可形成腹水瘤。無菌抽取腹水約 3ml，癌性腹水呈黃色渾濁樣或淡紅色洗肉水樣。取少量稀釋并計數 ，之后腹水 800r/min離心約 5min，棄上清，沉淀細胞用 PBS緩沖液稀釋，調節懸液細胞濃度至 4X107/ml。實驗組小鼠 10%水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位，左側腋窩皮膚消毒，皮下緩慢注射細胞懸液 0.8ml（細胞數約 3X107）。注射針退出后穿刺點針口消毒。待動物出瘤。

1.2.2 乳腺癌組織標本

瘤體形成后，處死小鼠，取下瘤體組織和瘤體周圍組織，清洗掉表面血跡后立即放入室溫保存的RNAlater溶液中，4℃過夜保存，然后-80℃保存。所有標本均經過病理證實。切片制備：切片脫蠟至水，在PBS中平衡10分鐘，以蒸餾水新鮮配制的3%H202室溫20分鐘滅活內源性過氧化物酶。微波修復抗原：將切片浸入PH6.0、0.01M枸椽酸鹽緩沖液，微波爐高火加熱5分鐘。緩慢冷卻后，放在PBS中再平衡10分鐘。備用。

1.2.3 實時熒光定量PCR

采Trizol試劑盒分別提取其總RNA，使用DNaseI試劑提純;紫外分光光度儀測定A260/A280值;采用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，-80℃保存備用;引物合成DNMT2：5-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3，5-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3，擴增產物152bp;反應條件為：94℃預變性5 min; 94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸3 min， ?30個循環;72℃延伸10 min，收集溶解曲線;以倍比稀釋的cDNA作為模板，檢測循環閾值（Ct）可采用2-Δt法計算其相對表達量。

1.2.4 免疫組化染色

石蠟切片脫臘，3%H2O2 室溫孵30 min，然后 PBS 沖洗，滴加 10%正常山羊血清封閉液 37 ℃孵育 30 min; 加入一抗兔抗大鼠抗體 （1：100稀釋）孵育，PBS 沖洗，滴加二抗山羊抗兔 IgG 孵育，PBS 沖洗， 滴加試劑辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A / HRP）孵育，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察計數。

1.3 統計分析

采用 SPSS 16.0 統計學軟件對實驗結果數據進行統計分析。各實驗均獨立重復 3 次，結果數據用 表示。多組間比較應用單因素方差分析，組內兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。以 P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中DNMT2 mRNA 表達水平比較

DNMT2 mRNA 在乳腺癌組織中的相對表達水平顯著高于乳腺癌旁組織（P< 0.05）。具體見圖1。

2.2 ?乳腺癌組織DNMT2免疫組化染色

乳腺癌組織中DNMT2表達程度及陽性表達率顯著增加。具體見圖2。

3 討論

乳腺癌的發生機制主要包含有遺傳學和表觀遺傳學兩種，其中表觀遺傳學機制在乳腺癌的發生、發展過程中起著越來越重要的作用[3]。DNA啟動子區域的異常甲基化研究的最為深入，主要過程為S-腺昔甲硫氨酸上的甲基在DNMT酶催化的作用下連接到胞嚓陡或腺嘌呤上面形成mC的一種可逆過程，DNMT活性或者功能表達水平的改變可能會誘導機體產生部分疾病甚至腫瘤的發生[4]。目前研究發現甲基化轉移酶有DNMT 1，DNMT2，DNMT3a和DNMT3b等4種亞型，DNMTl、DNMT3a和DNMT3b等在胚胎形成及發育、誘導疾病中發揮重要的作用，但DNMT2的作用機制目前還不很清楚[5]。

乳腺癌占據乳腺癌的15%，是一種侵略性很強的癌癥，這種類型的乳腺癌是由于缺乏特定的受體蛋白，結合存在的荷爾蒙雌激素和孕激素正常的乳腺細胞[6]。乳腺癌常出現TP53突變，而其他常見癌基因的點突變出現頻率較低，因而其對靶向治療效果不佳[7]。在“美國國家科學院院刊”上，研究人員發現，乳腺癌細胞極易受干擾素-β一種有效的抗微生物藥物的影響，這種抗微生物藥物也能激活免疫系統。這項新的研究顯示干擾素-β損害乳腺癌細胞遷移和形成腫瘤的能力。該研究還表明干擾素-β治療可以改善某些乳腺癌患者的治療效果。之后研究人員使用乳腺癌組織數據庫驗證了他們的實驗室結果[8]。

綜上所述，DNMT2在乳腺癌組織中存表達，DNMT2基因的檢測可能為了解乳腺的發病機制提供參考，且DNMT2的表達也可作為乳腺癌預后判斷的依據。

參考文獻：

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[5]郭為偉， 高靜， 周磊，等. DNA甲基轉移酶在胚胎停育絨毛組織中的表達差異及臨床意義[J]. 國際婦產科學雜志， 2016（2）：203-206.

[6]Jordan M. Reese et al. ERβ inhibits cyclin dependent kinases 1 and 7 in triple negati-ve breast cancer， Oncotarget （2017）. DOI： 10.18632/oncotarget.21787.

[7]張丹峰， 楊宏偉， 王曼. DNMTs基因在乳腺癌組織中表達的檢測[J]. 寧夏醫科大學學報， 2019（4）：384-387.

[8]蘇暢， 賈英杰， 李小江，等. 香菇多糖聯合AdIRF3通過刺激IFN-β表達抑制乳腺癌生長[J]. 中草藥， 2019， 50（05）：118-123.

項目基金編號：長沙醫學院大學生創新創業計劃訓練項目：長醫教[2021]47號-116

第一作者：謝濟陽，（2000.6-），男，本科，臨床醫學專業

通訊作者：何嫻婕（1983.12-），本科，講師，研究方向：婦產科教學