高AMH水平患者血清維生素B12水平與IVF-ET結局的關系

王曉寧，羅麗娟，刁紅錄，3，4，張昌軍，4*

(1.十堰市人民醫院 湖北醫藥學院附屬人民醫院生殖醫學中心，十堰 442000；2. 湖北省生殖醫學臨床醫學研究中心，十堰 442000；3.湖北醫藥學院生物醫藥研究院，十堰 442000；4.湖北醫藥學院生物醫學工程學院，十堰 442000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術的應用是治療不孕癥的一項重大突破。盡管IVF的技術水平在不斷改進，部分患者體外受精助孕結局仍不甚理想[1]。由于不孕癥發病原因復雜，因此影響IVF成功率的因素在很大程度上并不十分明確。近年來，研究人員開始逐漸關注患者的飲食習慣，發現維生素B12等B族維生素的攝入在生殖健康方面具有關鍵作用。維生素B12缺乏會導致高同型半胱氨酸血癥，而高同型半胱氨酸血癥對于IVF助孕結局有著不利的影響[2]。研究發現，維生素B12低水平與女性亞生育能力之間存在關聯[3]。Boxmeer等[4]發現，在IVF患者中，維生素B12和良好的胚胎形態之間存在正相關關系。一項前瞻性隊列研究發現，輔助生殖(ART)過程中給予患者葉酸強化補充，在ART前已經測得血清維生素B12高水平的人群活產率更高[5]。1998年一篇關于維生素B12與IVF關系的病例報道中就提到，維生素B12水平低的女性在卵巢儲備功能正常的情況下，可能存在對卵巢刺激低反應的情況[6]。參照輔助生殖技術臨床關鍵指標質控專家共識[7]，在輔助生殖治療中，抗苗勒管激素(AMH) 是評價卵巢儲備功能的良好指標。一般情況下，卵巢正常反應患者的AMH 水平高于1～1.4 ng/ml、低于3.5～4.0 ng/ml。目前，針對不同卵巢儲備功能的人群，維生素B12與IVF關系仍需進一步探討驗證。因此，本研究選取高AMH水平接受IVF-ET的患者，通過檢測患者血清維生素B12水平，分析高AMH水平患者血清維生素B12水平與IVF-ET助孕結局的相關性，進一步驗證維生素B12與IVF的關系，以期尋找影響IVF-ET成功率的因素，改善助孕結局。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2018年11月至2019年12月在湖北醫藥學院附屬十堰市人民醫院生殖醫學中心接受IVF助孕治療的患者臨床資料。

納入標準：(1)符合不孕癥診斷標準；均為第1周期助孕；(2)均采用長方案(卵泡期深長降調節方案)；(3)AMH≥3.5 ng/ml。

排除標準：(1)嚴重的內科疾病如高血壓、糖尿病者；(2)合并其他影響代謝的內分泌疾病(如甲狀腺疾病、高泌乳素血癥等)；(3)進入周期前1個月內有補充葉酸或含有維生素B12成分的藥物者。

本研究共納入符合標準的患者591例。

二、研究方法

1.促排卵及IVF-ET[8]：采用深長降調節長方案(月經期降調節)促排卵，從月經第3天開始使用醋酸曲普瑞林(達必佳，輝凌，德國)3.75 mg行垂體降調節，30～40 d后加用注射用重組人促卵泡素(果納芬，雪蘭諾，瑞士) 或/和注射用尿促性素(HMG，珠海麗珠) 75 U/d行超促排卵，促排卵期間B 超監測卵泡發育情況。當直徑達18 mm 的卵泡>2個時，停用果納芬和HMG，注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，雪蘭諾，瑞士)250 μg扳機，36 h后在B超引導下行穿刺取卵術。于取卵后第3～5天進行胚胎形態學評分[9]，選擇優質胚胎進行胚胎移植，采用 B 超引導下的宮腔內移植。

2.血清維生素B12檢測及分組：所有患者進入周期前常規化學發光法檢測血清維生素B12水平。根據文獻報道[10]，將血清維生素B12水平低于298 pg/ml的患者定義為低水平組，血清維生素B12水平介于298～350 pg/ml者定義為正常組，血清維生素B12水平高于350 pg/ml者定義為高水平組。

3.觀察指標：(1)基礎臨床資料，包括年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、AMH水平、基礎生殖激素水平、不孕類型、不孕原因；(2)促排卵指標，包括Gn用藥總量、Gn用藥總天數、扳機日FSH、扳機日LH、扳機日E2、扳機日孕酮(P)及獲卵數；(3)實驗室指標[11]，包括成熟卵率=MⅡ卵母細胞數/獲卵數×100%、受精率=受精卵數/MⅡ卵母細胞數×100%、正常受精率=正常受精卵數/受精卵數×100%、優胚率=優質胚胎數/2PN胚胎總數×100%、可用胚胎率=可用胚胎數/2PN胚胎總數×100%、囊胚形成率=囊胚形成數/囊胚培養數×100%；(4)結局指標[12]：臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%、異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%、流產率=自然流產周期數/臨床妊娠周期數×100%、活產率=活產周期數/臨床妊娠周期數×100%、多胎活產率=活產多胎周期數/臨床妊娠周期數×100%。

參照Cummins等[9]根據形態學參數將早期胚胎劃分為4級，Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優質胚胎，Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級胚胎為可移植胚胎。

三、統計學分析

結 果

一、患者一般情況比較

本研究共納入患者591例，根據血清維生素B12水平分為低水平組(173例)、正常組(97例)、高水平組(321例)。3組患者的平均年齡、不孕年限、BMI、AMH水平、基礎生殖激素水平、不孕類型、不孕原因均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、患者的促排卵及胚胎發育情況比較

3組患者間的Gn用藥總量、Gn用藥總天數、扳機日LH、E2和P水平、獲卵數、成熟卵率、受精率、正常受精率、優胚率以及囊胚形成率均無顯著性差異(P>0.05)；但維生素B12高水平組扳機日FSH水平顯著高于其它兩組(P<0.05)，而維生素B12低水平組的可用胚胎數顯著高于其它兩組(P<0.05)(表2)。

表2 三組患者促排卵情況比較[(-±s)，%]

三、3組患者的妊娠結局

統計結果顯示，3組患者的臨床妊娠率、異位妊娠率、流產率、活產率及多胎活產率的差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 三組患者的臨床妊娠結局比較[(-±s)，%]

四、影響可用胚胎數的單因素Logistic回歸分析

選擇對可用胚胎數有影響的臨床指標(年齡、BMI、不孕類型、不孕年限、bFSH、基礎竇卵泡數、獲卵數、維生素B12水平)進行單因素Logistic回歸分析。結果顯示，年齡(OR=-0.032，P=0.047)、獲卵數(OR=0.251，P<0.001)均與可用胚胎數相關(表4)。

表4 可用胚胎數相關因素回歸分析

五、影響可用胚胎數的多因素Logistic回歸分析

以維生素B12低水平組為參照，校正混雜因素(年齡、獲卵數)，結果顯示維生素B12高水平組的可用胚胎數顯著低于維生素B12低水平組(OR=-0.287，P=0.007)(表5)。

表5 影響可用胚胎數的多因素logistic回歸分析

討 論

維生素B12(鈷胺素)作為單碳代謝的關鍵參與者，與同型半胱氨酸、編碼5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因的遺傳變異一樣，對卵巢反應和妊娠結局都有影響[5]。若體內維生素B12低水平，甲硫氨酸循環不能正常進行，可能出現以下情況：(1)蛋氨酸的合成受阻，蛋氨酸合成酶受損，作為甲基的供體，由甲硫氨酸激活形成的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)減少，使機體處于“低甲基化”狀態，從而可能導致基因表達異常[14]，干擾神經遞質、蛋白質的合成。(2)同型半胱氨酸的積累，可能導致細胞毒性和氧化應激，導致卵母細胞成熟、胚胎發育和內皮細胞受損[15]。已有研究表明，高同型半胱氨酸血癥導致卵母細胞質量差以及胚胎質量差，進而導致不良的妊娠結局[16]。

關于維生素B12水平與疾病相關性的綜述中提到，血清維生素B12高水平可能與腎功能衰竭、癌癥、血液系統惡性腫瘤(如急性和慢性白血病)、白細胞增多、肝臟疾病(如肝硬化和肝炎)和肝細胞癌等疾病相關[17]。隨著人們對于生殖健康的重視以及ART技術的發展，近年來研究人員逐步將研究重點放在了維生素B12 等微量元素對生殖健康的影響上。研究發現，多囊卵巢綜合征患者卵泡發育不良可能與血清維生素B12水平降低有關[18]。也有學者對卵巢儲備功能正常人群中維生素B12與IVF的關系進行研究[6]。而針對不同卵巢儲備功能的人群，維生素B12與IVF的關系仍需進一步探討驗證。因此，本研究選取高AMH水平接受IVF-ET的患者，按照血清維生素B12水平進行分組，將3組患者的妊娠結局進行比較分析。根據Jatoi等[10]的研究報道，血清維生素B12水平介于298～350 pg/ml為維生素B12充足組，因此本研究將血清維生素B12水平低于298 pg/ml定義為維生素B12低水平組，298～350 pg/ml為維生素B12正常組，高于350 pg/ml定義為維生素B12高水平組。結果顯示3組患者的臨床妊娠率、異位妊娠率、流產率、活產率均無顯著差異(P>0.05)，這與之前的大型隊列研究發現血清葉酸和維生素B12濃度與IVF-ET患者妊娠結局沒有關系的結果一致[19]。本研究中盡管維生素B12高水平組活產率、多胎活產率高于其他兩組，但尚無統計學差異。這與Haggarty 等[19]發現在血漿葉酸和維生素B12濃度較高的婦女中，雙胞胎的出生率明顯較高有相似之處。考慮原因為維生素B12高水平組的人群體內B族維生素可能會增加胚胎種植后的活產率。

Boxmeer等[4]的隊列研究發現，血清維生素B12濃度和卵泡、胚胎質量呈正相關。但是本研究發現，在高AMH水平患者中維生素B12高水平組患者的可用胚胎數顯著低于維生素B12低水平組。可能因為本研究人群為高AMH水平患者，研究人群的異質性導致結果不一致。此外，維生素B12是影響同型半胱氨酸濃度的重要因素之一，Boxmeer等[4]的研究也推測卵泡生長或者胚胎發育可能需要一個最佳的同型半胱氨酸濃度。高同型半胱氨酸的不良影響可能來自于活性氧的過量產生，與其誘導過度的氧化應激有關。然而，卵泡液中生理水平的活性氧對卵母細胞成熟、排卵和受精都是必要的[20-21]，極低的同型半胱氨酸濃度也可能有害。本研究發現，在高AMH水平人群中，高水平的維生素B12可能導致同型半胱氨酸濃度過低，從而降低可用胚胎數。目前國內外研究尚未見高水平維生素B12對卵母細胞、胚胎或者妊娠結局不利影響的報道。本研究首次發現在高AMH水平患者中，高水平的維生素B12對于可用胚胎數有不利的影響。關于減肥手術后女性患者AMH水平變化的研究發現，隨著減肥手術時間增加維生素B12水平與AMH都有逐漸降低的趨勢，由此推測維生素B12水平可能與AMH水平增減趨勢一致，推測在高AMH水平人群中，體內儲存的維生素B12應該處于飽和狀態[22]。因此即使血清出現維生素B12低水平的狀態仍然不影響體內維生素B12的正常代謝，不影響可用胚胎數，但具體機制仍需進一步研究探索。

綜上所述，影響IVF-ET助孕結局的因素有很多，鑒于本研究中發現高AMH水平患者中的維生素B12高水平組在可用胚胎數上明顯占劣勢，盡管具體機制需要進一步研究，但是在臨床工作中仍應考慮對于該類人群避免攝入過量的維生素B12，以提高患者的助孕效果。