不同凍存保護劑對未性成熟小鼠睪丸生精細胞凍存的影響

張嘯龍，張杰平，王金玉，于嵐，馮科，曲曉偉，夏彥清，郭海彬，萬鋒，張翠蓮*

(1.鄭州大學人民醫院 河南省人民醫院，鄭州 450003；2.河南大學人民醫院，鄭州 450003；3河南大學醫學院，鄭州 450003)

青春期前男性腫瘤患者，因睪丸內尚無成熟精子，性腺毒性治療可能會導致生育能力永久性喪失，睪丸組織或細胞低溫凍存是保存其生育力重要的手段[1]。然而，在全身性腫瘤患者中，睪丸組織冷凍及復蘇后自體移植意味著患者可能再次引入癌細胞的高風險[2]。考慮到睪丸細胞懸浮液可以進行分選清除癌細胞，而精原干細胞(SSC)可以在體外培養用于精原干細胞移植[3-4]或誘導分化成圓形精子細胞，通過圓形精子細胞注射(ROSI)獲得子代。因此，對于青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細胞凍存是其保存生育力重要的途徑之一。非梗阻性無精子癥(NOA)是男性不育的一種重要類型[5]，特別是睪丸內無精子給NOA治療帶來巨大的挑戰。研究發現，部分NOA患者睪丸存在SSC和圓形精子細胞，SSC可以通過體外誘導分化形成單倍體圓形精子細胞，而圓形精子細胞可以通過ROSI而獲得遺傳學的子代[6-7]，因此SSC和圓形精子細胞作為生命的種子對于NOA患者的治療具有重要的臨床價值和意義。NOA患者的睪丸生精細胞保存是其生育力保存的重要的途徑，并具有潛在的臨床應用價值。

目前，國內外尚無完善的睪丸生精細胞的保存體系，對NOA和青春期前男性睪丸細胞凍存的研究報道更少。由于人類睪丸組織稀少且不易獲取，而小鼠作為研究哺乳動物胚胎發育以及人類遺傳疾病的典型模式動物，在生命科學領域發揮著至關重要的作用。本文選擇兩周齡小鼠來模擬人在青春期前未性成熟的睪丸發育狀態，采用不同的凍存方案對小鼠睪丸生精細胞進行低溫冷凍，并檢測凍存后生精細胞細胞活率、復蘇率、細胞凋亡、線粒體膜電位水平的變化，探索睪丸生精細胞最佳凍存方案。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：C57BL/6J雄性2周齡小鼠200只，購于河南省實驗動物中心，實驗動物生產許可證[SCXK(豫) 2017-0001]。

2.主要試劑和儀器：Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma試劑公司，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自上海碧云天生物技術公司；Ⅳ膠原酶、透明質酸酶、胰酶、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma試劑公司；蔗糖、D-海藻糖(細胞培養級)及DMEM/F12培養基購自上海聯邁生物工程有限公司。流式細胞儀(BD Canto plus，美國)、梯度降溫盒(Thermo Fisher，美國)。

二、實驗方法

1.實驗分組：根據凍存液組分不同分為5組。A組：DMEM/F12培養基中含10% DMSO、及10% FBS；B組：DMEM/F12培養基中含10% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L蔗糖；C組：DMEM/F12培養基含10% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L海藻糖；D組：DMEM/F12培養基中含15% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖；E組：DMEM/F12培養基中含10% DMSO、10% FBS及0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖。以新鮮睪丸組織解離后的睪丸生精細胞為對照組。

2.睪丸生精細胞懸液制備：采用兩步酶解法制備小鼠睪丸生精細胞懸液[8]，步驟簡述如下：將2周齡雄性C57BL/6J小鼠脫頸處死，取出雙側睪丸，清洗后剝除白膜，取20 mg睪丸組織，用眼科剪剪碎睪丸組織<1 mm，轉移至15 ml無菌離心管，410g室溫離心10 min，棄上清液，留取下層組織沉淀；添加酶Ⅰ4 ml，水浴鍋中37℃孵育15 min，孵育過程中持續振蕩酶解組織懸液；410g室溫離心30 s，棄上清液，留取下層組織沉淀；加酶Ⅱ4 ml，水浴鍋中37℃孵育15 min，孵育過程中持續振蕩酶解組織懸液；添加10% FBS 4 ml終止消化，410g室溫離心10 min，棄上清液，DMEM/F12培養基4 ml重懸，410g室溫離心10 min，0.45 μm細胞濾器過濾細胞懸液去除組織碎片；分裝于5個1.5 ml離心管中，410g室溫離心10 min，棄上清液。分別加入A、B、C、D、E組凍存保護劑1 ml，轉移至對應的5個1.8 ml凍存管(每管接收相當于4 mg睪丸組織所制備的細胞)。

3.睪丸生精細胞懸液的的冷凍和復蘇：程序化冷凍：將上述各組凍存管置于梯度降溫盒中，按照說明書操作，-80℃冰箱中12 h，轉移至液氮中凍存。復蘇[9]：2個月后從液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中2～3 min，待完全融化后，轉移至15 ml離心管中，并添加 DMEM/F12培養基3 ml，室溫410g離心5 min，洗滌2次，棄上清液，無菌PBS 1 ml重懸，用于后續實驗。對照組的睪丸生精細胞懸液不作冷凍處理，直接進行后續實驗。

4.細胞活率檢測：臺盼藍拒染法進行細胞活率檢測，將細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9：1混合混勻，室溫孵育5 min。染色后，立刻在倒置顯微鏡200倍下隨機取數個視野觀察細胞并計數，每個樣本統計細胞總數不少于1 000個。活細胞形態圓而透亮，臺盼藍染料拒染；死細胞被臺盼藍染料成藍色。活細胞率(%)=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%。

5.生精細胞凋亡檢測：采用Annexin V-FITC/PI試劑盒及流式細胞儀檢測睪丸生精細胞凋亡。步驟簡述如下：懸浮細胞1 000g離心5 min，棄上清，PBS洗滌細胞2次，收集細胞(1～5×105)，加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μl Anexin V-FITC混勻，加入10 μl碘化丙啶染色液(PI)輕輕混勻后室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。使用鋁箔進行避光。孵育過程中重懸細胞2～3次。1 h內用流式細胞儀上機檢測，Anexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。并以新鮮消化的睪丸生精細胞作為對照組進行對比分析。

6.線粒體膜電位檢測：采用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)及流式細胞儀檢測睪丸生精細胞線粒體膜電位。取1～6×105個細胞，重懸于0.5 ml細胞培養液中，加入0.5 ml JC-1染色工作液，顛倒數次混勻置于細胞培養箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 ml JC-1染色緩沖液(5×)加入4 ml蒸餾水的比例，配制JC-1染色緩沖液(1×)，并放置于冰浴。37℃孵育結束后，600g4℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。用JC-1染色緩沖液1 ml洗滌2次，再用1 ml JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細胞儀測定熒光強度，激發波長488 nm(綠色)，發射波長 530 nm(紅色)，熒光強度的變化與對照組比較。

三、統計學方法

結 果

一、各組生精細胞凍存前后細胞活率及復蘇率

與凍存前比較，5組(A～E)細胞凍存復蘇后的細胞活率均顯著下降(P<0.05)；5組間凍存復蘇后的細胞活率及復蘇率比較中，A組細胞活率及復蘇率顯著低于其余4組，E組的細胞活率及復蘇率顯著高于其余4組(P<0.05)，B、C及D組間差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 冷凍前后各組睪丸生精細胞細胞活率及復蘇率(-±s)

二、各組睪丸生精細胞凍存后細胞恢復情況

以每4 mg睪丸組織解離凍存后實際回收的活細胞數，對睪丸細胞凍存復蘇后進行定量計算。統計結果顯示，E組睪丸生精細胞的恢復數量[(17.83±0.84)×104]最高，顯著高于其余4組(P<0.05)；A組的恢復數量[(10.82±0.43)×104]最低，顯著低于其余4組(P<0.05)；B、C、D組間沒有顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

與其余4組比較，*P<0.05、#P<0.05。

三、各組間睪丸生精細胞凋亡水平的比較

流式細胞儀檢測細胞凋亡。統計結果顯示，和對照組相比，凍存復蘇后5組細胞凋亡率均顯著增加[(57.08±2.40)% vs.(18.77±0.95)%、(47.42±1.74)% vs.(18.77±0.95)%、(54.06±2.13)% vs.(18.77±0.95)%、(45.19±2.29)% vs.(18.77±0.95)%、(29.62±1.95)% vs.(18.77±0.95)%](P<0.05)；5組凍存細胞間的細胞凋亡率比較，A組細胞凋亡顯著高于其余4組(P<0.05)，E組細胞凋亡率顯著低于其余4組(P<0.05)，而B、C、D組間的細胞凋亡率無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

與其余各組比較，*P<0.05；與B、C、D、E組比較，#P<0.05；與A、B、C、D組比較，&P<0.05。

四、各組睪丸生精細胞線粒體膜電位的比較

膜電位下降程度用R1/R2表示，R1與R2的比值越高說明線粒體膜電位越高。統計結果顯示，和對照組相比，凍存復蘇后5組細胞線粒體膜電位均顯著下降[(1.13±0.12) vs.(4.73±0.25)、(1.62±0.18)vs.(4.73±0.25)、(1.53±0.14) vs.(4.73±0.25)、(1.27±0.15)vs.(4.73±0.25)、(3.58±0.23) vs.(4.73±0.25)](P<0.05)；5組凍存細胞間的線粒體膜電位下降程度比較，E組下降程度最低，顯著低于其余4組(P<0.05)，而A、B、C和D組間的下降程度無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

與其余各組比較，*P<0.05，#P<0.05。

討 論

無精子癥在男性不育人群中的發生率為10%～15%[10]，盡管近年來輔助生殖技術的快速發展，但是針對NOA特別是睪丸內無精子患者來說，輔助生殖技術卻無計可施，然而幸運的是部分NOA患者睪丸存在精原干細胞。此外，對于即將接受性腺毒性治療的青春期前男性腫瘤患者，雖然睪丸內尚無成熟精子，但卻有精原干細胞。針對NOA睪丸內無精子患者和青春期前男性腫瘤患者，睪丸組織或細胞低溫凍存是唯一一種保存其生育力的方法[1]。睪丸組織或細胞低溫凍存后復蘇，然后進行睪丸組織或細胞移植是一種生育力保存和恢復的方案，已在多種物種進行實驗[11-17]。例如，Fayomi 等[18]將低溫保存的青春期前恒河猴睪丸組織自體移植到其背部皮膚或陰囊內成功產生功能性精子并能生育后代；在人類中，對非霍奇金淋巴瘤患者的睪丸細胞進行低溫冷凍，待患者康復后將冷凍的睪丸細胞復蘇并移植到他們的睪丸中[19-20]。然而，目前尚無針對睪丸組織或細胞懸液冷凍保存的最佳方案[21]。此外，對于青春前期全身性腫瘤患者，其睪丸組織可能存在癌細胞污染，需將睪丸組織解離成細胞懸液后進行分選，清除癌細胞后進行睪丸生精細胞冷凍，最后復蘇后進行移植。因此，對于NOA睪丸內無精子患者和青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細胞凍存是其保存和恢復生育力重要的方法。

低溫凍存保護劑在睪丸生精細胞凍存和復蘇過程中起著重要的作用。冷凍保護劑可分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑，其中常用的滲透性保護劑是DMSO，因其分子量小，細胞膜穿透性強，在細胞凍存和復溫過程中能降低細胞內冰晶的形成，從而對睪丸組織及細胞懸液能起到較好的保護作用，是目前睪丸組織冷凍最常用的冷凍保護劑。非滲透性保護劑中最常用的是蔗糖、海藻糖，可在脫水和復水化過程中，通過形成粘性外殼穩定細胞膜來保護細胞。Jahnukainen等[22]用10%蔗糖、5%和10%的DMSO冷凍保護劑冷凍保存恒河猴睪丸組織，復蘇后將睪丸組織移植到裸鼠背部皮下，結果能夠啟動精子發生過程。Lee等[23]用添加胎牛血清的DMSO和海藻糖的冷凍保護劑冷凍保存小鼠睪丸細胞懸液，復蘇后和無海藻糖的冷凍保護劑組相比，小鼠SSCs的細胞活力顯著提高，并保持了SSCs的細胞功能。雖然國內外研究者嘗試用的多種冷凍保護劑保存睪丸生精細胞，但其冷凍復蘇效果尚不十分理想，且冷凍復蘇效果檢測指標單一(細胞活率)。本研究采用含有不同成分(DMSO、FBS、蔗糖、海藻糖)和濃度的冷凍保護劑對未性成熟小鼠睪丸生精細胞進行冷凍保存，然后檢測冷凍復蘇后細胞活率、細胞凋亡和細胞線粒體膜電位，力求尋找更佳的冷凍方案。

本研究結果顯示，與新鮮對照組比較，凍存復蘇后各組細胞活率均顯著下降，細胞凋亡率顯著升高且細胞線粒體膜電位顯著降低；其中添加0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖的凍存組的細胞活率和復蘇率均最高、細胞凋亡率最低、細胞線粒體膜電位程度最低；未添加0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖的組別的細胞活率和復蘇率均是最低，其細胞凋亡率最高。提示在細胞冷凍處理中，冷凍保護劑中添加0.1 mol/L蔗糖或0.1 mol/L海藻糖對細胞低溫冷凍均具有一定的保護作用，而同時添加0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖可顯著提高睪丸生精細胞冷凍復蘇后細胞活率和復蘇率，降低細胞凋亡率，并降低低溫凍存對細胞線粒體膜電位損傷的影響，但15%DMSO對細胞的毒性卻抵消0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖的部分冷凍保護作用。結果表明，10%DMSO、10%FBS、0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L海藻糖組合冷凍劑對細胞膜及線粒體膜具有膜穩定的保護作用，是凍存未性成熟小鼠睪丸生精細胞較適宜的冷凍保護劑方案。

本研究尚存在一些不足，首先，濃度分組數量有限，而且限定了冷凍保護載體(凍存管)和冷凍方法(程序性降溫)進行比較不同的冷凍保護劑對睪丸生精細胞冷凍保護效果；此外，冷凍保護劑對睪丸生精細胞冷凍保護效果的檢測指標仍不全面，未對睪丸生精細胞功能進行檢測。因此，在未來研究中，需要增加濃度分組數量，增加睪丸生精細胞檢測指標，如細胞甲基化、細胞膜及細胞器形態的變化，并同時比較不同的冷凍載體和降溫程序，并對冷凍復蘇后細胞進一步培養以明確冷凍保護劑對睪丸生精細胞功能的影響，以探索更適合未性成熟睪丸組織生精細胞的冷凍保護劑，為臨床應用提供實驗證據和理論支持。