基于超分子傳感技術研究血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響

王璐瑤，張亞平，穆琦瑄，于卉娟，王躍飛

基于超分子傳感技術研究血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響

王璐瑤，張亞平，穆琦瑄，于卉娟*，王躍飛

天津中醫藥大學 省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 301617

基于超分子傳感技術研究血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響。采用離體外翻腸囊模型研究三甲胺的結腸吸收；基于指示劑置換分析策略，構建選擇性識別三甲胺的超分子熒光傳感體系，評價血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響。基于杯芳烴分子識別的超分子傳感體系實現了三甲胺的靈敏檢測；與對照組相比，血府逐瘀湯高劑量（5.0 mg/mL）組顯著降低結腸單位面積三甲胺的累積吸收量（＜0.05、0.01、0.001），血府逐瘀湯低劑量（2.5 mg/mL）組能夠減少結腸單位面積三甲胺的累積吸收量，但與對照組相比無顯著性差異。血府逐瘀湯能夠減少三甲胺的結腸吸收，為血府逐瘀湯活血化瘀作用提供一定依據。

超分子傳感；血府逐瘀湯；指示劑置換分析；三甲胺；外翻腸囊法

三甲胺是膽堿、甜菜堿及肉堿等經腸道菌群代謝生成的產物，經肝臟黃素單加氧酶3（flavin-containing monooxygenase 3，FMO3）轉化生成氧化三甲胺（trimethylamine-oxide，TMAO）[1]。研究表明，血漿TMAO水平升高可導致血小板高反應性，增加血栓形成風險，與心血管事件的發生呈正相關[2-3]。因此，通過干預三甲胺的吸收，減少三甲胺向TMAO的轉化，減少TMAO的生成，從而降低血栓形成風險，有助于預防心血管疾病的發生。血府逐瘀湯源自清代王清任的《醫林改錯》，具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，臨床上廣泛用于心血管疾病的預防和治療[4-5]。目前，關于血府逐瘀湯是否調控三甲胺的結腸吸收鮮有報道。

三甲胺相對分子質量小，無顯色團，為強極性的有機小分子。目前檢測三甲胺的方法主要為氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜聯用法、核磁共振法[6]，但檢測前樣品需進行衍生化或同位素標記等預處理，存在操作繁瑣、分析時間長、檢測成本高等缺點。基于指示劑置換分析（indicator displacement assay，IDA）的超分子傳感技術，通過指示劑熒光信號改變實現分析物的檢測，具有操作簡單、靈敏度高等優勢。基于IDA策略，本課題組前期構建了胍基杯[5]芳烴-熒光素鈉主客體對傳感體系，提供了一種易操作、低成本、無標記、靈敏檢測TMAO的方法，實現了人工尿液和模擬疾病尿液中TMAO的檢測[7]。本研究構建超分子熒光傳感體系識別檢測三甲胺，探究血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響，旨在闡明血府逐瘀湯調控與血栓形成相關的三甲胺-TMAO通路的作用。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。動物飼養于天津藥物研究院新藥評價有限公司，室溫22～25 ℃，相對濕度（40±10）%。動物實驗經天津藥物研究院新藥評價有限公司實驗動物管理與使用委員會批準（批準號2020060801）。

1.2 藥材

柴胡、川芎、炒桃仁、紅花、當歸、赤芍、炒枳殼、生地、桔梗、甘草、牛膝飲片購自河北美威藥業股份有限公司，經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定分別為傘形科植物柴胡DC.的干燥根、傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖、薔薇科植物桃(L.) Batsch的干燥成熟種子、菊科植物紅花L.的干燥花、傘形科植物當歸(Oliv.) Diels的干燥根、毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根、蕓香科植物酸橙L.及其栽培變種的干燥未成熟果實、玄參科植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根、桔梗科植物桔梗(Jacq.) A. DC.的干燥根、豆科植物甘草Fisch.干燥根和根莖、莧科植物牛膝Bl.的干燥根，均符合《中國藥典》2020年版飲片質量標準。

1.3 藥品與試劑

氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化鎂、氯化鈣、葡萄糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；稀鹽酸購自天津市化學試劑供銷公司；三甲胺（批號BCBZ6954）購自美國Sigma-Aldrich公司；惡嗪1（oxazine 1，OX1，批號AAT-89）購自武漢艾美捷科技有限公司；磺化杯[4]芳烴（-sulfonatocalix[4]arene，SC4A）由南開大學化學學院郭東升教授惠贈。

1.4 儀器

Varian Cary Eclipse型熒光分光光度計（美國安捷倫科技有限公司）；ME 204型萬分之一天平、MS 105DU型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FDU-2110型冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）；DB043型離體器官測量系統（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司）；Centrifuge 5424R型臺式離心機（德國艾本德股份公司）；Milli-Q超純水儀（美國密理博公司）。

2 方法

2.1 樣品及溶液的制備

2.1.1 血府逐瘀湯凍干粉的制備 取4 g當歸、4 g柴胡、6 g桔梗、6 g川芎、8 g甘草、8 g炒枳殼、8 g赤芍、12 g生地、12 g紅花、12 g牛膝、15 g炒桃仁，置于圓底燒瓶中，加入8倍量水，回流提取2次，每次提取2 h，合并水提液，濃縮，冷凍干燥，得血府逐瘀湯凍干粉末，備用。根據本課題組已建立方法[8]，測定血府逐瘀湯凍干粉中主要成分的含量，凍干粉樣品含苦杏仁苷3.50 mg/g、芍藥苷5.33 mg/g、阿魏酸0.27 mg/g、柚皮苷7.28 mg/g、新橙皮苷6.18 mg/g、甘草酸1.96 mg/g。

2.1.2 Tyrode緩沖液的配制 按照文獻方法[9]配制Tyrode緩沖液：取0.28 g氯化鉀、8.0 g氯化鈉、0.05 g磷酸二氫鈉、1.0 g碳酸氫鈉、0.1 g氯化鎂，溶于500 mL蒸餾水中，攪拌均勻；取0.2 g氯化鈣溶于500 mL蒸餾水中，攪拌均勻；將上述溶液混合均勻，臨用前加入1.0 g葡萄糖，用稀鹽酸調pH至7.4，備用。

2.1.3 樣品溶液的制備 取血府逐瘀湯凍干粉，精密稱定，用Tyrode緩沖液分別配制質量濃度為5.0、2.5 mg/mL的血府逐瘀湯樣品溶液，備用。

取SC4A、OX1、三甲胺，精密稱定，分別用超純水配制成濃度為100 mmol/L、100 μmol/L、100 mmol/L的儲備液，備用。

2.2 外翻腸囊模型的構建與取樣

按照文獻方法[9]構建外翻腸囊模型。Wistar大鼠實驗前16 h禁食，自由飲水，隨機分成5組，每組6只。大鼠ip 3%戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg），剝離大鼠腸管，剪取結腸（4～7 cm），用Tyrode緩沖液沖洗至無內容物。將腸管一端結扎，翻轉腸管，另一端結扎成囊狀。向腸囊內注入1 mL Tyrode緩沖液，將其放入麥氏浴槽（20 mL Tyrode緩沖液）中，并向浴槽中通入95% O2和5% CO2，保持37 ℃，平衡5 min，將麥氏浴槽中的Tyrode緩沖液放出，分別加入20 mL樣品溶液：5 mmol/L三甲胺（三甲胺對照組）、5.0 mg/mL血府逐瘀湯（高劑量血府逐瘀湯對照組）、2.5 mg/mL血府逐瘀湯（低劑量血府逐瘀湯對照組）、5.0 mg/mL血府逐瘀湯＋5 mmol/L三甲胺（高劑量血府逐瘀湯測試組）、2.5 mg/mL血府逐瘀湯＋5 mmol/L三甲胺（低劑量血府逐瘀湯測試組），分別于15、30、45、60、90、120 min時從腸囊內取樣200 μL，同時補足相同體積的Tyrode緩沖液。各組實驗結束后將腸管縱向剖開，自然攤于濾紙上測量長度和寬度，計算結腸吸收面積。

2.3 熒光分光光度計實驗條件

2.3.1 檢測溶液的配制 將“2.2”項下采集的腸囊液，12 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，用Tyrode緩沖液稀釋10倍，加入SC4A（測試體系中終濃度為0.4 mmol/L）和OX1（測試體系中終濃度為1 μmol/L）混勻，總體積為1 mL，進行熒光檢測。由于腸囊液經Tyrode緩沖液稀釋10倍后進行熒光檢測，故測試體系中血府逐瘀湯質量濃度為0.50、0.25 mg/mL。

2.3.2 檢測條件 采用配備Cary Single-cuvette Peltier比色皿控溫裝置的Varian Cary Eclipse熒光光譜儀進行檢測，樣品池為石英比色皿，光程為10 mm；熒光滴定試驗均在37 ℃下進行。

在目標跟蹤系統中，解決非線性濾波最常用的方法是EKF方法及其相關改進算法。CKF算法是近年來新出現的一種非線性濾波算法，該算法利用了三階球面-徑向容積積分準則進行了嚴密的數學推導，在理論上對該算法具有嚴格的保證[5-6]，估計精度和數值穩定性都比較高。在對CKF算法深入研究的基礎上，有學者提出了降維CKF算法[6-7]，并將降維CKF成功應用于工程實踐[7-8]。

2.3.3 數據統計 熒光滴定數據采用主客體1∶1包結模型擬合公式（oneHost_oneGuest，oneHost_ oneGuest_oneCompetitor）擬合[7]，獲得主客體對鍵合常數（association constant，a）。a、線性關系、檢測限（LOD）的測定均重復3次試驗。

3 結果

3.1 杯芳烴超分子熒光傳感體系的構建

在超分子熒光傳感體系中，為了提高熒光靈敏度，降低干擾物的影響，選擇具有高熒光量子效率及與大環主體分子有強鍵合的染料作為指示劑，確保大環分子-染料主客體絡合時熒光強度發生顯著變化。基于IDA策略，分析物（競爭客體）與染料競爭大環主體的空腔，將染料從絡合物中置換出來，引起體系熒光強度增大或減小，從而實現分析物的傳感檢測[10]。

染料OX1具有較高的熒光量子效率，與大環主體SC4A絡合后自身熒光被淬滅，傳感體系熒光強度變化范圍寬，是杯芳烴超分子傳感體系的理想熒光指示劑[11]。而且，在Tyrode緩沖液中，OX1（1 μmol/L）熒光強度不受三甲胺（13 mmol/L）和血府逐瘀湯（0.50、0.25 mg/mL）的影響（圖1）。

圖1 在三甲胺 (13 mmol·L?1)或血府逐瘀湯(0.50、0.25 mg·mL?1) 條件下OX1 (1 μmol·L?1) 的熒光光譜(λex＝648 nm，λem＝660～800 nm)

血府逐瘀湯藥味多，化學成分復雜。為評價SC4A?OX1主客體對傳感體系對三甲胺檢測的識別選擇性，系統考察了在血府逐瘀湯樣品溶液（0.50、0.25 mg/mL）中SC4A對三甲胺的包結能力。

在Tyrode緩沖液中，將SC4A（0～2.45 mmol/L）逐步滴加到OX1（1 μmol/L）中，大環主體分子SC4A與指示劑OX1發生可逆結合，OX1的熒光信號被顯著淬滅，獲得一系列隨SC4A增加而熒光強度降低的熒光發射光譜（圖2-A）。將OX1熒光光譜最大發射波長處（668 nm）的熒光強度與SC4A的濃度采用主客體1∶1包結模型擬合公式（oneHost_ oneGuest）進行擬合，獲得SC4A?OX1主客體對鍵合常數，即a＝（2.44±0.04）×103L/mol。

將三甲胺（0～12.48 mmol/L）逐步滴加到SC4A?OX1（0.4 mmol/L?1 μmol/L）主客體對溶液中，三甲胺與OX1競爭SC4A的空腔，將OX1從SC4A?OX1絡合物中置換出來，OX1恢復在溶液中的熒光信號，如圖2-B所示。將OX1熒光光譜最大發射波長處（668 nm）的熒光強度與三甲胺的濃度采用主客體1∶1競爭包結模型擬合公式（oneHost_ oneGuest_oneCompetitor）進行擬合，得SC4A?三甲胺主客體對鍵合常數，即a＝（4.42±0.28）×103L/mol。

Tyrode緩沖液(A)、0.50 mg·mL?1血府逐瘀湯 (C)、0.25 mg·mL?1血府逐瘀湯(E) 中SC4A (0～2.45 mmol·L?1) 與OX1 (1 μmol·L?1)的熒光滴定光譜（插圖為OX1在λem＝668 nm的熒光強度與SC4A濃度的非線性擬合曲線）；Tyrode緩沖液(B)、0.50 mg·mL?1血府逐瘀湯(D)、0.25 mg·mL?1血府逐瘀湯(F) 中三甲胺 (0～12.48 mmol·L?1) 與SC4A?OX1 (0.4 mmol·L?1 ?1 μmol·L?1) 主客體對的熒光競爭滴定光譜（插圖為OX1在λem＝668 nm的熒光強度與三甲胺濃度的非線性擬合曲線）

結果表明，在Tyrode緩沖液、血府逐瘀湯（0.50、0.25 mg/mL）中測得SC4A?三甲胺主客體對鍵合常數基本一致，鍵合較強，即在高、低質量濃度血府逐瘀湯中SC4A能夠選擇性識別三甲胺，實現三甲胺傳感檢測。

3.2 Tyrode緩沖液、血府逐瘀湯樣品溶液中三甲胺測定標準曲線的建立

基于IDA策略，分析物與染料競爭大環分子主體的空腔，在一定濃度范圍內隨著分析物濃度的增加，染料熒光強度呈線性增加，從而構建分析物檢測的標準曲線。在Tyrode緩沖液中，SC4A?OX1（0.4 mmol/L?1 μmol/L）主客體對的熒光強度隨三甲胺（0～0.62 mmol/L）濃度增加呈線性增加，以三甲胺濃度和OX1熒光強度（em＝668 nm）變化的比值（/0，其中0和分別為未加入和加入三甲胺時OX1熒光信號強度值）進行線性擬合，得線性方程，＝442.82＋1.008 7（2＝0.995 2），如圖3-A所示。根據3/slope法計算三甲胺的LOD[12-13]，計算得Tyrode緩沖液中三甲胺的LOD為（32.78±2.63）μmol/L。同理在0～0.62 mmol/L，0.50 mg/mL血府逐瘀湯樣品溶液（圖3-B）和0.25 mg/mL血府逐瘀湯樣品溶液（圖3-C）中建立了三甲胺檢測的標準曲線，LOD分別為（36.06±5.10）、（35.08±3.35）μmol/L。

圖3 在Tyrode緩沖液 (A)、0.50 mg·mL?1血府逐瘀湯樣品溶液(B)、0.25 mg·mL?1血府逐瘀湯樣品溶液(C) 中OX1熒光強度比值與三甲胺濃度的線性擬合方程

3.3 腸囊溶液中三甲胺的測定

本研究構建了SC4A?OX1超分子主客體對傳感體系識別檢測三甲胺，探究血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響。

將“2.3.1”項下各測試液進行熒光檢測，三甲胺對照組、高劑量血府逐瘀湯對照組、低劑量血府逐瘀湯對照組、高劑量血府逐瘀湯測試組、低劑量血府逐瘀湯測試組所測的熒光強度分別記為對照、高對照、低對照、高測試、低測試。Tyrode緩沖液中SC4A?OX1（0.4 mmol/L?1 μmol/L）熒光強度值記為0。

將三甲胺對照組熒光變化值（對照/0）、高劑量血府逐瘀湯測試組熒光變化值（高測試/高對照）、低劑量血府逐瘀湯測試組熒光變化值（低測試/低對照）分別代入“3.2”項中Tyrode緩沖液、0.50 mg/mL血府逐瘀湯、0.25 mg/mL血府逐瘀湯中測得的標準曲線，計算得測試溶液中三甲胺濃度（mmol/L），記為C（＝15、30、45、60、90、120 min）。因為測試樣品在測試時稀釋10倍，故各腸囊中三甲胺的濃度為10C。三甲胺結腸累積吸收量（）按照公式（1）[9]計算，三甲胺結腸單位面積累積吸收量（μg/cm2）按照公式（2）[9]計算。

平衡為平衡前腸囊中加入Tyrode緩沖液（1 mL）的體積，樣為每次取樣的體積（200 μL），C'為各取樣時間點腸囊中三甲胺的質量濃度（mg/L），C'為第（＋1）時腸囊中三甲胺的質量濃度（mg/L）；代表離體腸囊面積（cm2），為剪開腸囊后量取其長度和寬度的乘積

如圖4所示，腸囊離體培養15～120 min，與三甲胺對照組比較，5.0 mg/mL血府逐瘀湯測試組中三甲胺結腸單位面積累積吸收量明顯降低，且30、45、60、120 min時具有顯著性差異（＜0.05、0.01、0.001）；2.5 mg/mL血府逐瘀湯測試組中三甲胺結腸單位面積累積吸收量與對照組相比呈降低趨勢，但無顯著性差異。

與三甲胺對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

4 討論

近年來，超分子化學在生物、環境、醫藥等領域發揮重要作用[14]。超分子化學主要研究2種或2種以上的分子通過非共價弱相互作用力（如氫鍵、靜電作用、疏水作用等）結合形成的聚集體（超分子）[15]。環糊精、杯芳烴、葫蘆脲等大環主體分子是超分子化學重要組成部分。在超分子傳感領域中，IDA是由美國化學家Eric V. Anslyn教授研發的熒光傳感策略[16]，是基于指示劑（染料客體）、分析物（競爭客體）與大環主體的競爭性結合，導致測試體系熒光信號增敏（switch-on）或淬滅（switch-off），從而將微觀的分子識別行為轉化為宏觀的易于觀察的熒光信號，從而實現分析物的檢測。這種基于IDA策略的超分子傳感檢測不受限于分析物有無發色團，無需同位素標記，具有操作簡單、信號靈敏、檢測通量高等優勢。本研究基于IDA策略，構建了SC4A?OX1超分子主客體對傳感體系（圖5），以a為評價指標，評價了Tyrode緩沖液、血府逐瘀湯中SC4A對三甲胺識別的選擇性，實現了三甲胺的靈敏檢測。

圖5 IDA示意圖

方劑通過干預免疫應答、影響微生物酶代謝系統、調控腸道菌群，從而干預疾病[17]。膳食中的膽堿、甜菜堿及肉堿類物質經腸道菌群代謝產生三甲胺，在肝臟中經FMO3氧化成心血管“危險分子”TMAO，誘發心血管疾病。近年來，已有研究報道白藜蘆醇[18]、葫蘆巴堿[19]、黃連素[20]等中藥成分通過重塑腸道菌群，抑制膽堿向三甲胺轉化，減少三甲胺產生，降低體內TMAO水平，從而降低心血管疾病風險。目前，關于血府逐瘀湯抗TMAO誘導的血栓性疾病研究主要聚焦于其入血成分調控的三甲胺-FMO3-TMAO通路，通過抑制FMO3活性，抑制TMA向TMAO的體內轉化，減少TMAO生成，從而延緩或阻斷心血管疾病的發生與發展[11]。本研究采用離體外翻腸囊模型研究血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響，結果表明，血府逐瘀湯可抑制結腸吸收三甲胺，為血府逐瘀湯調控與血栓形成相關的三甲胺-TMAO通路的作用提供了依據。

本研究基于IDA策略構建了杯芳烴超分子傳感體系，實現了三甲胺的靈敏檢測，探究了血府逐瘀湯對三甲胺結腸吸收的影響。血府逐瘀湯能夠減少三甲胺結腸的吸收，為揭示血府逐瘀湯調控與血栓形成相關的三甲胺-TMAO通路的機制提供了科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Xuefu Zhuyu Decoction on trimethylamine absorption based on supramolecular sensing technology

WANG Lu-yao, ZHANG Ya-ping, MU Qi-xuan, YU Hui-juan, WANG Yue-fei

State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin Key Laboratory of TCM Chemistry and Analysis, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To study the effect of Xuefu Zhuyu Decoction (血府逐瘀湯) on trimethylamine (TMA) absorption based on supramolecular sensing technology.The model of everted intestinal sac was used to explore the affection of Xuefu Zhuyu Decoction on colon absorption of TMA. Based on the indicator displacement assay, a supramolecular fluorescence sensing system was established for selective recognition of TMA, which was employed to evaluate the effect of Xuefu Zhuyu Decoction on colonic absorption of TMA.The established supramolecular sensing method can successfully detect TMA via molecular recognition of calixarene. Compared with control group, the cumulative absorption of TMA per unit area of colon in high-dose Xuefu Zhuyu Decoction (5.0 mg/mL) group was significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001), and there was no significant difference in low-dose Xuefu Zhuyu Decoction (2.5 mg/mL) group.Xuefu Zhuyu Decoction can reduce colonic absorption of TMA, which provides the basis for the role of Xuefu Zhuyu Decoction in promoting blood circulation and removing blood stasis.

supramolecular sensing; Xuefu Zhuyu Decoction; indicator displacement assay; trimethylamine; everted intestinal sac

R285.5

A

0253 - 2670(2022)06 - 1783 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.021

2021-11-12

國家自然科學基金資助項目（81873192）

王璐瑤（1997—），女，碩士，主要從事中藥藥效物質及質量控制研究。Tel: (022)59596366 E-mail: W1224967197@163.com

于卉娟（1988—），女，助理研究員，主要從事中藥藥效物質及質量控制研究。Tel: (022)59596366 E-mail: huijuanyu@tjutcm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]