基于GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技術的荊防顆粒化學成分研究

梁紅寶，姜宇珺，袁曉梅，姚景春，邱榮英，楊 敏，張貴民，李 峰*

基于GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技術的荊防顆粒化學成分研究

梁紅寶1, 2, 3，姜宇珺2, 3，袁曉梅3，姚景春2, 3，邱榮英2，楊 敏1，張貴民2, 3，李 峰1*

1. 山東中醫藥大學，山東 濟南 250355 2. 山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂 276006 3. 魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006

對荊防顆粒化學成分進行系統分析，并分析其裂解規律。采用GC-MS技術對荊防顆粒中揮發性化學成分和UPLC-Q-Exactive MS技術在正、負離子模式下對荊防顆粒中非揮發性化學成分進行定性分析。通過GC-MS數據庫匹配，共鑒別出了24個化合物，包括萜類19個、醛類2個、酯類2個、芳香醚類1個。通過質譜信息并結合對照品、相關文獻、數據庫檢索，液質聯用共鑒別出了85個化合物，包括香豆素類25個、木脂素類6個、黃酮苷15個、黃酮類15個、有機酸類9個、糖苷類5個、三萜類4個和其他類化合物6個。建立了荊防顆粒的GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS的分離鑒定方法，為闡釋該復方的功效物質基礎提供了依據。

荊防顆粒；GC-MS；UPLC-Q Exactive MS；裂解規律；萜類；香豆素；木脂素

荊防顆粒是根據荊防敗毒散方劑，采用現代制藥工藝提取加工濃縮制成的中成藥制劑。荊防敗毒散出自明代張時徹的《攝生眾妙方》，由人參敗毒散加減而成，去溫補人參而無助邪化毒之弊，加荊芥、防風助力疏散透利，其治療范圍從傷寒、瘟疫之類，擴展到“傷寒外感、多種疫病、痘疹瘡瘍”等更廣泛的疾病。且徐春甫《古今醫統大全》中也有記載：“瘟疫通治劑，荊防敗毒散，治天行時疫，發散瘟邪。”清代沈金鰲的《雜病源流犀燭》中也提及“溫病初癥，未知端的，先以荊防敗毒散治之。”本方由荊芥、防風、柴胡、川芎、羌活、獨活、前胡、茯苓、桔梗、枳殼、甘草共11味中藥組成。主治發汗解表、散風祛濕，可用于風寒感冒、頭痛身痛、鼻塞清涕，臨床效果較為顯著。荊防顆粒作為抗疫名方荊防敗毒散的成方制劑，2020年已被國內多省份指定為新冠肺炎預防推薦用藥，新疆、云南、四川等地的《新冠病毒感染的中醫藥防治方案》中都推薦了荊防顆粒作為新冠病毒感染輕癥的指導用藥。

荊防顆粒化學成分的現代研究包括，劉雯等[1]采用HPLC同時測定了荊防顆粒中6種成分，為荊防顆粒的質量控制提供方法；李云靜等[2]采用HPLC波長切換聯合梯度洗脫法同時測定荊防敗毒丸中10個成分的含量；馮雪等[3]采用LC-ESI/MS方法同時測定荊防敗毒口服液中4個有效成分含量。但未見關于荊防顆粒組方中全成分鑒定的相關報道，本文利用GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技術對荊防顆粒中化學成分進行定性分析，并分析其裂解規律。

1 材料與儀器

Thermo scientific trace 1310 ISQ/LT氣相色譜-質譜聯用儀（賽默飛世爾科技公司，美國），UPLC-Q-Exactive MS四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（賽默飛世爾科技公司，美國），Thermo TR-V1色譜柱（30 m×0.25 mm，1.4 μm，賽默飛世爾科技公司，美國），Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，沃特世科技有限公司，美國），萬分之一天平和十萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），GTSONIC-P13型超聲波清洗器（江蘇蘇州江東精密儀器有限公司），揮發油提取裝置，電子調溫電熱套（河南豫華儀器有限公司）。對照品新綠原酸（批號DST180130-015，質量分數≥98%）購自成都德斯特生物技術有限公司；對照品新橙皮苷（批號111857-201804，質量分數≥98%）、柚皮苷（批號110722-201714，質量分數≥93%）、紫花前胡苷（批號111821-201604，質量分數≥98%）、綠原酸（批號110753-201716，質量分數≥98%）、升麻素苷（批號111522-201712，質量分數≥96%）、甘草苷（批號110610-201908，質量分數≥95%）和阿魏酸（批號110773-201614，質量分數≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院。荊防顆粒（批號0012101001、0012101005、0012104007、0012010007、0012012009）由山東新時代藥業提供；水為純凈水，乙腈、甲醇、甲酸為質譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 GC-MS條件

2.1.1 色譜條件 Thermo TR-V1色譜柱（0.25 mm×30 m，1.4 μm），以高純氦氣為載氣，初始溫度為80 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持20 min。進樣口溫度為200 ℃，分流比10∶1，體積流量1.0 mL/min，進樣量為0.1 μL。

2.1.2 質譜條件 電離方式為EI，電子能量為70 eV，傳輸線和離子源溫度均為230 ℃，掃描質量范圍為/30～500。

2.2 UPLC-Q-Exactive MS條件

2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSSC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，5% B；2～25 min，5%～40% B；25～35 min，40%～70% B），體積流量為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為0.3 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（HESI-Ⅱ），正、負離子模式切換檢測；鞘氣為氮氣，體積流量為10.5 L/min；輔助氣為氮氣，體積流量為3.0 L/min；毛細管溫度為350 ℃，噴霧電壓為3.5 kV。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取各對照品適量，加甲醇配制成含新橙皮苷1.055 mg/mL、柚皮苷0.125 mg/mL、綠原酸0.135 mg/mL、紫花前胡苷0.125 mg/mL、新綠原酸0.132 mg/mL、升麻素苷0.122 mg/mL、甘草苷0.136 mg/mL、阿魏酸0.122 mg/mL的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱內，備用。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 氣質供試品的提取及制備 分別取5批次樣品各2袋，照《中國藥典》2020年版揮發油測定法（通則2204甲法）提取揮發油，稱取本品100 g，置圓底燒瓶中，加10倍量水，加熱回流提取至揮發油提取器中油量不再增加，用無水硫酸鈉干燥，精密量取荊防顆粒揮發油100 μL，即得供試品溶液，備用。

2.4.2 液質供試品溶液的制備 分別取5批次樣品各2袋，除去包裝，混勻，然后取樣品適量，研細，精密稱定10.0 g，置錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量后，超聲30 min，放冷，并用甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得液質供試品溶液，避光，置于冰箱中4 ℃，備用。

2.5 數據處理及成分分析

經計算機數據處理，各色譜峰經氣質工作站NIST 14質譜數據庫系統和標準圖庫檢索，并參照相關文獻進一步確認揮發油的化學成分，按色譜峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。通過液質質譜所得數據中的精確相對分子質量，在可能的元素組成范圍內推斷其分子式。并參照相關文獻以及TCMSP數據庫并結合對照品、特征性多級質譜裂解碎片及相對豐度等信息，分析各化合物裂解規律，進一步確認化學成分。

3 結果

3.1 總離子流色譜圖的建立

荊防顆粒氣質總離子流圖和在正、負離子模式下荊防顆粒液質的總離子流圖，如圖1、2所示。初步觀察發現儀器較穩定且總離子流圖清晰，可以用來進行數據分析，且其結果有較高的可靠性。

1～24號峰對應的化合物見表1

3.2 化合物的分析與鑒定

通過所得數據中的精確相對分子質量，并在可能的元素組成范圍內推斷其分子式。本實驗從荊防顆粒中共鑒定出110個化合物，其中通過氣質聯用技術，從荊防顆粒揮發油中共鑒定出24個化合物，包括萜類19個、醛類2個、酯類2個、芳香醚類1個，具體化合物信息見表1。通過液質聯用技術，從荊防顆粒中共鑒定出85個化合物，包括香豆素類25個、木脂素類6個、黃酮苷15個、黃酮類15個、有機酸類9個、糖苷類5個、三萜類4個和其他類化合物6個。其中正離子裂解信息及鑒定結果見表2，負離子裂解信息及鑒定結果見表3。

圖I-A中1～50號峰對應的化合物見表2；圖I-B中1～35號峰對應的化合物見表3；圖II中1-新綠原酸 2-綠原酸 3-升麻素苷 4-阿魏酸 5-紫花前胡苷 6-柚皮苷 7-新橙皮苷 8-甘草苷

3.3 化合物的裂解規律分析

3.3.1 黃酮及黃酮苷類 該類化合物在荊防顆粒中數量較多，主要來自甘草和枳殼。其中黃酮苷類化合物居多，黃酮苷多見丟失1個糖基以及環的斷裂產生的碎片。該類化合物在質譜裂解過程中容易發生脫糖基、脫水、環的裂解，以及CO、CO2、CHO等一些中性分子丟失[35]。以負離子模式下化合物11、15和19為例，在[M－H]?的準分子離子峰分別為/549.161 38（C26H30O13）、593.151 55（C27H30O15）和609.182 37（C28H34O15）。化合物11失去1個芹糖基和1個葡萄糖基后，發生RDA裂解，得到/255 [M－H－Api－Glc]?和119 [M－H－Api－Glc－C8H8O2]?碎片。化合物15失去2個鼠李糖基后，再失去1個羥基，最后發生RDA裂解，得到/285 [M－H－2Rha]?、271 [M－H－2Rha－OH]?和119 [M－H－2Rha－OH－C8H8O3]?碎片。化合物19失去1個鼠李糖基和1個葡萄糖基，得到/447 [M－H－Rha]?和285 [M－H－Rha－Glc]?碎片。因此，化合物11、15和19被初步確定為芹糖甘草苷、山柰酚-3--蕓香糖苷和新橙皮苷。化合物19通過對照品比對，確定是新橙皮苷。裂解途徑如圖3。

3.3.2 香豆素類 該類化合物在荊防顆粒中數量也相對較多，主要來自前胡和獨活。由于香豆素類分子中一般具有多個和芳環連接的氧原子、羥基，故其質譜裂解規律一般連續失去CO、OH、H2O、CH3或OCH3的碎片離子峰。以正離子模式下化合物38為例，在[M＋H]+的準分子離子峰為/217.049 59 (C12H8O4），首先失去1個甲基，得到/202 [M＋H－CH3]+碎片，再連續失去2個羰基得到/174 [M＋H－CH3－CO]+和145 [M＋H－CH3－CO－CO]+碎片；或在準分子離子峰基礎上連續失去3個羰基，得到/189 [M＋H－CO]+、161 [M＋H－CO－CO]+和133.100 78 [M＋H－CO－CO－CO]+碎片；或在準分子離子峰基礎上首先失去1個甲氧基，得到/185 [M＋H－CH3OH]+的碎片，再連續失去2個羰基，得到/158 [M＋H－CH3OH－CO]+和129 [M＋H－CH3OH－CO－CO]+碎片。因此，化合物38被初步確定為花椒毒素。裂解途徑見圖4。

表1 荊防顆粒揮發油中鑒定的揮發油成分及其相對質量分數

Table 1 Volatile composition and their relative mass percentage of Jingfang Granules

序號tR/min相對分子質量分子式化合物名稱相對百分含量/%分類 18.074100.16C6H12O正己醛[4-8]0.182醛類 211.747136.23C10H162-側柏烯0.495萜類 312.145136.23C10H163-蒈烯[9-10]16.081萜類 412.860136.23C10H16莰烯[8-10]0.388萜類 513.707136.23C10H16β-水芹烯[9]2.308萜類 613.917136.23C10H16β-蒎烯[8-9,11-12]8.928萜類 713.999136.23C10H16諾品烯0.959萜類 814.764136.23C10H16α-側柏烯[10]0.415萜類 915.210136.23C10H164-蒈烯[10]0.550萜類 1015.393128.21C8H16O正辛醛[4,7,9,10] 0.160醛類 1115.662136.23C10H16D-檸檬烯[8] 31.192萜類 1215.720134.22C10H14鄰傘花烴[10]6.595萜類 1316.067136.23C10H16β-羅勒烯[8,10]1.058萜類 1416.621136.23C10H16γ-松油烯[8,9] 13.735萜類 1518.679154.25C10H18O芳樟醇[8] 0.179萜類 1621.033154.25C10H18O左旋薄荷酮[12]7.502萜類 1721.505154.25C10H18O4-萜烯醇[8,10]1.000萜類 1822.097154.25C10H18Oα-松油醇[10] 0.245萜類 1922.638164.24C11H16O麝香草酚甲醚0.710芳香醚類 2023.784152.23C10H16O胡薄荷酮[11-12] 2.837萜類 2124.617196.29C12H20O2乙酸龍腦酯[10]0.567酯類 2228.311204.35C15H24β-石竹烯[8,12] 0.241萜類 2329.947204.35C15H24紫穗槐烯0.675萜類 2439.225190.22C12H14O2反式藁本內酯[10]0.592酯類

表2 正離子模式下荊防顆粒的化學成分分析

Table 2 Identification of compounds in Jingfang Granules under positive ion mode

序號tR/min相對分子質量誤差(×10?6)化合物名稱分子式碎片離子(m/z)藥材歸屬分類實測值理論值 15.21235.169 27235.169 81?2.29艾里莫芬內酯C15H22O2235.169 27d木脂素類 211.34193.049 68193.050 09?2.68東莨菪內酯[13] C10H8O4193.049 68, 177.054 86b、c、d、k木脂素類 311.77257.080 66257.081 39?2.84八仙花酸C15H12O4257.080 66, 239.070 36, 211.075 55, 163.039 05f有機酸類 412.49421.165 37421.165 12?0.59甘草寧H[14]C25H24O6421.165 37k黃酮類 513.42209.117 20209.128 335.40洋川芎內酯J[14]C12H18O4209.117 20, 163.111 76, 153.054 28, 116.966 53, 91.054 73j木脂素類 615.08341.138 43341.138 90?1.38甘草香豆酮C20H20O5341.138 43, 323.127 66, 308.105 19, 271.095 95, 165.054 75k香豆素類 715.56469.170 35469.170 99?1.36升麻素苷* [15] C22H28O11469.170 35, 219.065 41b糖苷類 816.47187.039 05187.039 522.51異補骨脂素[16]C11H6O3187.039 05, 159.044 16c、d、g香豆素類 916.71303.049 90303.050 48?1.91槲皮素C15H10O7303.049 90, 257.080 72a、g、h、k黃酮類 1016.88433.112 27433.113 47?2.77芹菜苷元-7-葡萄糖苷C21H20O10433.112 27, 273.060 21j糖苷類 1116.98273.075 71273.076 30?2.16柚皮素C15H12O5273.075 71, 255.065 16e黃酮類 1217.11257.080 66257.081 39?2.84松屬素C15H12O4257.080 66, 148.047 55j黃酮類 1317.61307.118 63307.118 161.53升麻素[17]C16H18O6307.118 63b香豆素類 1417.65287.055 57287.054 932.23木犀草素[18]C15H10O6287.055 57, 153.018 20a、i黃酮類 1517.71247.096 36247.097 04?2.75異紫花前胡內酯[19]C14H14O4247.096 36, 229.085 78, 189.054 93, 175.038 93c、b、d、g木脂素類 1618.02195.066 27195.065 732.77阿魏酸* [16,20-22]C10H10O4195.066 27, 125.023 51c、d、g、j有機酸類 1718.09409.147 83409.149 86?4.96紫花前胡苷*[9-10,13,16,23] C20H24O9409.147 83, 227.073 35, 179.054 51c、d、g糖苷類 1818.39265.097 20265.097 70?1.86川芎哚[14]C16H12N2O2265.097 20, 247.085 63, 219.091 32, 206.083 98j生物堿類 1919.98317.065 52317.066 131.92異鼠李素C16H12O7317.065 52, 285.040 50k黃酮類 2020.22191.033 49191.034 44?4.97萘醌C10H6O4191.033 49b萘醌類 2120.70207.101 59207.102 12?4.953-丁烯基-4-羥基苯酞[14] C12H14O3207.101 59, 189.091 02, 147.080 52, 133.101 38, 105.070 27j苯酞類 2221.80301.107 52301.107 60?3.50珊瑚菜素[13]C17H16O5301.107 52, 233.043 85, 187.040 36b、c、g香豆素類 2322.10241.092 75241.091 953.32川芎內酯S[20-22]C12H16O5241.092 75, 185.096 63, 171.080 49j木脂素類 2422.57247.096 53247.097 04?2.06日本前胡醇C14H14O4247.096 53, 229.085 98, 201.091 17, 175.038 99g香豆素類 2522.58221.189 91221.190 53?2.80β-異側柏萜醇C15H24O221.189 91d三萜類 2624.02287.090 85287.091 95?3.83甘草查耳酮B[23-24] C16H14O5287.090 85, 195.091 83k黃酮類 2724.47285.075 59285.076 30?2.49金合歡素C16H12O5285.075 59, 253.049 67i黃酮類 2824.64247.096 51247.097 04?2.14狹蓬芹內酯C14H14O4247.096 51, 229.085 97g香豆素類 2925.19285.075 74285.076 30?1.96山槐素C16H12O5285.075 74k酚酸類 3026.08485.325 84485.326 70?1.77茯苓新酸BC30H44O5485.325 84, 467.315 55, 421.310 12, 403.298 46f有機酸類 3126.60289.107 27289.107 601.14當歸酮C16H16O5289.107 27, 207.028 99d香豆素類

續表2

序號tR/min相對分子質量誤差(×10?6)化合物名稱分子式碎片離子（m/z）藥材歸屬分類 實測值理論值 3228.07217.049 48217.050 09?2.81香柑內酯[11,25-26] C12H8O4217.049 48, 202.025 59c、b、d、g香豆素類 3328.57355.153 55355.154 55?2.811-甲氧基菜豆素C21H22O5355.151 55k香豆素類 3429.17355.153 82355.154 55?2.06羌活醇[27] C21H22O5257.164 81, 185.021 22c香豆素類 3529.68191.106 67191.107 212.83Z-藁本內酯[14]C12H14O2191.106 67, 173.096 47, 117.070 10, 103.054 48, 71.049 93j酯類 3629.71471.346 74471.347 441.49白頭翁酸C30H46O4471.346 74, 425.340 73a有機酸類 3729.74269.080 75269.081 39?2.38刺芒柄花素C16H12O4269.080 75, 237.055 71k黃酮類 3829.81217.049 59217.050 09?2.30花椒毒素[13]C12H8O4217.049 59, 202.026 1, 189.090 33, 185.131 99, 174.127 49, 161.095 54, 158.095 99, 145.100 77, 133.100 78, 129.069 56a、b、g香豆素類 3929.87247.060 09247.060 65?2.27異茴芹靈C13H10O5247.060 09, 217.013 24b、d、g香豆素類 4030.04403.138 00403.139 30?3.22川陳皮素[28-29] C21H22O8403.138 00, 373.091 40e黃酮類 4130.41217.049 59217.050 09?2.30異佛手柑內酯C12H8O4217.049 59, 202.026 14g香豆素類 4230.98285.075 59285.076 30?2.49毛異黃酮C16H12O5285.075 59k黃酮類 4331.35369.133 00369.133 82?2.22甘草香豆素C21H20O6369.133 00, 351.122 13k香豆素類 4431.46315.086 52315.086 86?1.08熊竹素C17H14O6315.086 52k黃酮類 4531.59271.096 41271.097 04?2.32異歐前胡素[13,16]C16H14O4271.096 41, 256.072 36, 231.101 59, 201.054 55, 175.038 91b、c、d、g香豆素類 4632.30367.116 23367.118 17?0.80甘草酚[23-24] C21H18O6367.115 23k木脂素類 4733.21337.103 91337.107 60?5.28光果甘草酮[23-24] C20H16O5337.103 91, 256.263 28k黃酮類 4833.22387.143 43387.144 37?2.43白花前胡甲素[30]C21H22O7387.143 43, 327.122 59, 245.080 92g香豆素類 4934.00245.116 96245.117 77?3.30蛇床子素[25] C15H16O3245.116 96, 203.034 39, 176.042 86b、d、g香豆素類 5034.08171.029 18171.029 36?1.05沒食子酸[20-22]C7H6O5171.029 18, 154.946 84j有機酸類

*對照品比對后確定的化合物；a-荊芥；b-防風；c-羌活；d-獨活；e-枳殼；f-茯苓；g-前胡；h-柴胡；i-桔梗；j-川芎；k-甘草（表3同）

*Compounds identified by comparison with the reference substance a-Briq. b-(Turcz.) Schischk. c-Ting ex H. T. Chang d-Maxim.f.Shan et Yuan e-L. f-(Schw.) Wolf g-Dunn h-DC. i-(Jacq.) A.DC. j-Hort. k-Fisch. (same as table 3)

此外，香豆素類成分經常具有異戊烯氧基，以正離子模式下化合物45為例，在[M＋H]+的準分子離子峰為/271.096 41（C16H14O4），首先失去1支鏈，得到/256 [M＋H－CH3]+和201 [M＋H－CH3－C4H7]+碎片；或失去1個甲基后，呋喃環斷裂再苯環上的碳氧鍵斷裂，得到/231 [M＋H－CH3－C2H2]+和175 [M＋H－CH3－C2H2－C3H4O]+碎片。因此，化合物45被初步確定為異歐前胡素。裂解途徑見圖5。

表3 負離子模式下荊防顆粒的化學成分分析

Table 3 Identification of compounds in Jingfang Granules under negative ion mode

序號tR/min相對分子質量誤差(×10?6)化合物名稱分子式碎片離子（m/z）藥材歸屬分類實測值理論值 19.13129.092 26129.091 595.19庚酸C7H14O2129.092 26, 85.028 27c/h有機酸類 29.63353.088 10353.087 262.37新綠原酸* [31] C16H18O9353.088 10, 191.055 50, 135.044 10c有機酸類 310.91333.100 60333.099 732.61白當歸素C17H18O7333.100 60, 304.558 17, 202.135 25b香豆素類 412.34353.087 16353.087 26?0.28綠原酸* [16,31]C16H18O9353.087 16, 191.055 47, 179.034 24, 135.044 10c有機酸類 514.93513.321 80513.321 620.57茯苓酸D C31H46O6513.321 80, 388.876 53, 315.087 74, 287.092 53f有機酸類 615.03341.124 21341.123 651.64白花前胡苷C16H22O8341.124 21g糖苷類 715.40439.182 50439.187 63?1.17甘草新酚T C25H26O7439.182 50k黃酮類 815.75141.127 87141.127 94?0.49反式-2-壬烯-1-醇C9H18O141.127 87, 113.096 28, 84.020 52j醇類 916.32469.333 70469.331 794.07β-甘草次酸[32]C30H46O4469.333 70, 423.128 66, 243.065 58, 179.055 48, 161.044 89, 131.033 78k三萜類 1016.49577.156 62577.155 741.52佛萊心苷 C27H30O14577.156 62k黃酮苷類 1116.99549.161 38549.160 821.02芹糖甘草苷[23-24] C26H30O13549.161 38, 255.066 28, 119.048 93k黃酮苷類 1217.68417.119 14417.118 561.39甘草苷* [23-24] C21H22O9417.119 54, 255.066 31k黃酮苷類 1317.60463.087 86463.087 760.16金絲桃苷 C21H20O12463.087 86, 285.041 20, 301.034 45h黃酮苷類 1417.62447.093 84447.092 742.46紫云英苷[27] C21H20O11447.093 84, 285.040 74c/k黃酮苷類 1517.67593.151 55593.150 651.52山柰酚-3-O-蕓香糖苷C27H30O15593.151 55, 285.040 41, 271.061 43, 119.018 69k黃酮苷類 1619.47579.171 75579.171 380.64柚皮苷* [28]C27H32O14579.171 75, 271.061 49e/k黃酮苷類 1720.06425.161 39425.160 033.20白花前胡乙素[30,33]C24H26O7425.161 39g香豆素類 1820.06461.109 31461.108 39?2.00橙皮素-5-O-葡萄糖苷C22H22O11461.109 31, 283.025 12a黃酮苷類 1920.40609.182 37609.181 950.69新橙皮苷* [28-29]C28H34O15609.182 37,447.135 07,285.049 26e黃酮苷類 2020.83464.086 35464.087 762.19異懈皮苷C21H20O12464.086 35, 285.040 71, 301.071 44a/h/k黃酮苷類 2121.34549.161 50549.160 821.24異甘草苷元-4′-芹糖基葡萄糖苷[23-24] C26H30O13549.161 50, 255.066 33k黃酮苷類 2221.48579.169 19579.171 383.78甘草素-7,4′-二葡萄糖苷[14]C27H32O14579.169 19, 119.049 13k黃酮苷類 2321.81445.077 94455.077 091.87黃芩苷C21H18O11445.077 94, 269.045 59h黃酮苷類 2422.49417.119 54417.118 562.35新甘草苷[23-24] C21H22O9417.119 54, 255.066 31k黃酮苷類 2524.51583.182 43583.181 561.496′-阿魏酰基紫花前胡苷C30H32O12583.182 43, 207.065 32c糖苷類 2624.56285.075 62285.076 30?2.39氧化前胡素[30,33] C16H14O5285.075 62g香豆素類 2727.34577.155 50577.155 74?0.42異佛萊心苷C27H30O14577.155 50k黃酮苷類 2827.55297.040 53297.039 924.41異車軸草酚C16H10O6297.040 53, 282.017 40k香豆素類 2928.57301.033 78301.034 82?3.45橙皮素 C16H14O6301.033 78, 286.048 46e黃酮類 3029.32503.338 23503.337 271.91遠志酸C29H44O6489.136 47, 309.073 12i三萜類 3129.76821.396 91821.395 961.16甘草酸[14,32]C42H62O16821.396 91, 645.361 33, 469.185 91, 303.090 58, 304.915 01, 134.863 63k三萜類 3230.06375.145 69375.144 383.49當歸醇D[34]C20H24O7375.145 69, 357.174 47, 277.217 22, 183.138 40, 175.079 04d香豆素類 3331.50229.086 69229.086 470.967-(異戊烯基氧基)香豆素C14H14O3229.086 69, 174.031 51c香豆素類 3432.11381.134 52381.133 82?1.84格里西輪[14]C22H22O6381.134 52, 323.056 34k香豆素類 3532.83335.092 77335.091 95?2.45光果甘草香豆靈[14]C20H16O5335.092 77, 291.103 06k香豆素類

圖3 芹糖甘草苷 (11)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(15)和新橙皮苷(19) 的裂解途徑

圖4 花椒毒素裂解途徑

3.3.3 有機酸類 該類化合物的基本結構為酚羥基取代的芳香環、脂肪酸等，易在羰基處斷裂形成碎片離子。以負離子模式下化合物4為例，準分子離子峰353.087 16 （C16H18O9）。化合物4碳氧鍵斷裂，得到/191 [M－H－C9H6O3]?碎片，或與氧相連的環烷烴斷裂后，再失去1分子CO2，得到/179 [M－H－C7H10O5]?和135 [M－H－C7H10O5－CO2]?碎片。因此，化合物4初步確定為綠原酸，最后比對對照品明確化合物4為綠原酸。裂解途徑如圖6。

圖5 異歐前胡素裂解途徑

3.3.4 萜類 本方鑒定出的萜類化合物以三萜類為主，該類化合物易發生麥氏重排和環內裂解。以負離子模式下化合物31為例，在[M＋H]+的準分子離子峰為/821.396 91（C42H62O16）。化合物31連續首先脫去2個葡萄糖醛酸，得到/645 [M－H－C6H8O6]?和469 [M－H－2C6H8O6]?碎片，苷元結構進一步發生麥氏重排，并伴隨烯丙鍵均裂，生成/303 [M－H－2C6H8O6－C11H18O]?碎片或304 [M－H－2C6H8O6－C11H16O]?碎片，繼續丟失中性分子得到/135 [M－H－2C6H8O6－C11H16O－C10H18O2]?碎片。因此，化合物31被初步確定為甘草酸。裂解途徑見圖7。

圖6 綠原酸裂解途徑

以負離子模式下化合物9為例，在[M＋H]+的準分子離子峰為/469.333 70（C30H46O4）。化合物9失去1個羧基后具有環內雙鍵的六元環發生了裂解，得到具有AB環和DE環的/243 [M－H－COOH－C7H24O]?和179 [M－H－COOH－C12H20O]?碎片。然后/179碎片失去1分子水，再脫去2個甲基，得到/161 [M－H－COOH－C12H20O－H2O]?和/131 [M－H－COOH－C12H20O－H2O－2CH3]?碎片。因此，化合物9被初步確定為β-甘草次酸。裂解途徑見圖8。

4 討論

荊防顆粒源于“治疫第一方”人參敗毒散，即人參敗毒散去人參、生姜、薄荷加荊芥、防風而成，亦是治疫良方，被稱為“瘟疫通治劑”。本實驗首次對荊防顆粒的揮發油進行定性鑒定，通過氣質數據庫匹配，共鑒定出了24個化合物，包括萜類19個、醛類2個、酯類2個、芳香醚類1個。其中薄荷酮和胡薄荷酮是荊防顆粒君藥荊芥的主要成分[36]。且有文獻表明，胡薄荷酮對急性炎癥模型有抑制作用，是荊芥揮發油抗炎作用的物質基礎之一[37-38]。并有研究表明荊芥揮發油、薄荷酮及胡薄荷酮能顯著降低病毒感染小鼠肺組織病毒滴度，有明顯的抗病毒活性[38]。

液質實驗前期，為篩選最佳提取方法，分別用水、50%甲醇水溶液、甲醇作為提取溶劑，考察最佳提取溶劑及溶劑用量，結果表明采用2.5倍量甲醇提取時，各分析物響應最好，提取率最高，提取效果最優。通過質譜信息并結合對照品、相關文獻、數據庫檢索，液質聯用共鑒定出了85個化合物，包括香豆素類25個、木脂素類6個、黃酮苷15個、黃酮類15個、有機酸類9個、糖苷類5個、三萜類4個和其他類化合物6個。以上成分中，黃酮及黃酮苷類成分如橙皮素、川陳皮素、新橙皮苷等具有抗炎、抗腫瘤等藥理活性[39-40]，主要存在于枳殼和甘草中；香豆素類成分如異歐前胡素、羌活醇，蛇床子素等，主要存在于防風、羌活、獨活、前胡中；有機酸類成分如綠原酸、新綠原酸、阿魏酸等具有保護心血管、降糖、調脂等藥理作用[41-43]，主要存在于羌活中；三萜類成分如甘草酸、β-甘草次酸等，存在于甘草中；糖苷類成分如紫花前胡苷，主要存在于羌活中。本研究對荊防顆粒中化學成分進行了較為全面的分析，發現其所含有的主要成分與文獻報道的相關藥理活性成分具有良好的一致性，以上不同來源的不同活性成分可通過協同、互補等作用實現多成分、多靶點、多通路的治療效果，最終使荊防顆粒更好地發揮發汗解表、散風祛濕等功效。

圖7 甘草酸裂解途徑

圖8 β-甘草次酸裂解途徑

本實驗運用GC-MS技術可以較好地分析荊防顆粒中的揮發性成分，運用UPLC-Q Exactive MS 技術能夠較好地分析鑒定荊防顆粒中的醇溶性有機成分。2種技術合用，根據NIST 14質譜數據庫、精確相對分子質量和質譜碎片結構等信息，結合對照品的裂解規律和參考相關文獻，鑒定分析了荊防顆粒中109個化合物，并對鑒定出的部分化合物進行了藥材歸屬。此外，荊防顆粒質譜離子流圖中尚存在一些響應較好的色譜峰為未知成分有待進一步的實驗研究。本實驗建立的方法簡便、準確，可為荊防顆粒的藥效物質基礎研究及質量標準提升提供實驗依據。期望未來荊防顆粒能在全球新冠疫情防控中發揮積極作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents of Jingfang Granules based on GC-MS and UPLC-Q Exactive MS

LIANG Hong-bao1, 2, 3, JIANG Yu-jun2, 3, YUAN Xiao-mei3, YAO Jing-chun2, 3, QIU Rong-ying2, YANG Min1, ZHANG Gui-min2, 3, LI Feng1

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. Shandong New Time Pharmaceutical Co., Ltd., Linyi 276006, China 3. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China

To investigate the chemical composition of Jingfang Ganules (荊防顆粒), and analyze its fragmentation pattern.The volatile and non-volatile chemical components in Jingfang Granules were qualitatively analyzed by GC-MS and UPLC-Q-Exactive MS in positive and negative ion mode, respectively.A total of 24 compounds (19 terpenoids, two aldehydes, two esters and one aromatic ether) were identified by GC-MS. And a total of 85 compounds, (25 coumarins, six lignans, 15 flavonoid glycosides, 15 flavonoids, nine organic acids, five glycosides, four triterpenoids and six other compounds) were identified by UPLC-Q Exactive MS and combined with reference materials, related literatures and database retrieval.The separation and identification methods of Jingfang Granules by GC-MS and UPLC-Q Exactive MS were established, which provided a foundation for further research of pharmacodynamic material basis of it.

Jingfang Granules; GC-MS; UPLC-Q Exactive MS;fragmentation pattern; terpenoids; coumarins; lignans

R284.1

A

0253 - 2670(2022)06 - 1697 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.012

2021-09-06

國家重大新藥創制專項（2017ZX09301058）

梁紅寶（1985—），男，山東濟寧人，博士研究生，研究方向為中藥創新藥物。Tel: 18764932621 E-mail: lianghongbao1985@163.com

李 峰（1957—），男，教授，博士生導師，研究方向為中藥質量控制與資源研究。E-mail: 13969141796@163.com

[責任編輯 王文倩]