紅景天苷對高糖條件下血管內皮細胞凋亡和氧化應激的調節作用

范二紅 魯 平

1 西華第一醫院內分泌科，河南省周口市 466600； 2 河南省人民醫院內分泌科

2型糖尿病是我國最常見的內分泌代謝性疾病，具有發病率逐年升高但血糖控制達標率較低的流行病學特點。心腦血管并發癥是2型糖尿病常見的并發癥，血管內皮損傷是與糖尿病血管并發癥發生密切相關的病理環節，長期血糖升高能夠通過細胞凋亡、氧化應激、炎癥反應等途徑來引起內皮損傷[1-2]。因此，減輕高糖環境所引起的血管內皮損傷是防治糖尿病血管并發癥的重要靶點。紅景天苷是中藥紅景天中的活性成分，具有改善微循環、保護細胞等生物學作用。國內姜曉斐等研究報道紅景天苷能夠減輕低氧引起的內皮損傷[3]，但紅景天苷對高糖引起內皮損傷的保護作用及機制尚未明確。為此，本研究具體分析了紅景天苷對高糖條件下血管內皮細胞凋亡和氧化應激的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs，ATCC公司)，紅景天苷(中國藥品生物制品檢定所)，凋亡檢測試劑盒(TUNEL法，上海碧云天公司)，mRNA表達檢測試劑盒(北京康為世紀公司)，Bax、Bcl-2、Caspase-3、NOX2、NOX4的第一抗體購自Abcam公司，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組：HUVEC在含有10%胎牛血清的培養基中進行培養，細胞密度生長至85%～90%時，用0.25%的胰酶對細胞進行消化，離心收集消化后的細胞并進行常規傳代。傳代后接種在培養板中的細胞分為三組：對照組用低糖培養基(5.5mmol/L葡萄糖)處理，高糖組用高糖培養基(33mmol/L葡萄糖)處理，紅景天苷組用含有10μg/ml紅景天苷的高糖培養基處理。

1.2.2 細胞凋亡率的檢測：不同條件處理24h后，棄去培養基并用磷酸鹽緩沖液清洗細胞2遍，用TUNEL法進行凋亡檢測，按照試劑盒說明書進行操作后在顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞、DAPI陽性細胞，計數后計算細胞凋亡率。

1.2.3 基因mRNA及蛋白表達的檢測：不同條件處理24h后，棄去培養基并用磷酸鹽緩沖液清洗細胞2遍，加入Trizol裂解液提取RNA后進行熒光定量PCR反應，根據反應曲線計算Bcl-2、Bax、Caspase-3、NOX2、NOX4的mRNA表達水平；加入RIPA裂解液提取蛋白后進行western blot檢測，完成電泳、封閉、抗體孵育后通過ECL系統檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、NOX2、NOX4的蛋白表達水平。

1.2.4 氧化應激產物的檢測：不同條件處理24h后，取細胞培養基采用MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒測定MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0軟件處理數據，三組間計量資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組間細胞凋亡率比較 對照組的細胞凋亡率為(9.82±1.35)%、高糖組的細胞凋亡率為(33.58±6.61)%、紅景天苷組的細胞凋亡率為(15.23±2.24)%。與對照組比較，高糖組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組的細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

2.2 三組間凋亡相關基因表達比較 與對照組比較，高糖組細胞中Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2的mRNA及蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組細胞中Bax、Caspase-3的mRNA及蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2的mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 三組間凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3比較

2.3 三組間氧化應激相關基因表達比較 與對照組比較，高糖組細胞中NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組細胞中NOX2、NOX4的mRNA及蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組間氧化應激相關基因NOX2、NOX4比較

2.4 三組間氧化應激產物含量比較 與對照組比較，高糖組細胞培養基中MDA的含量明顯升高，SOD、GSH-Px含量明顯降低(P<0.05)；與高糖組比較，紅景天苷組細胞培養基中MDA含量明顯降低，SOD、GSH-Px含量明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 三組間氧化應激產物MDA、SOD、GSH-Px比較

3 討論

2型糖尿病患者血糖控制不佳會增加心腦血管并發癥的發生率。血糖控制不佳會導致患者長期處于高糖環境，血管內皮細胞在高糖的刺激下會發生損害并參與血管并發癥的發生。近年來，血管內皮損害與心腦血管疾病間的密切關系受到了越來越多的關注，血管內皮作為血液與血管壁之間的機械屏障，發生損害后會造成血小板、炎癥細胞等在損傷局部浸潤并逐步形成血栓，不加以干預會最終發展為血栓栓塞[4-5]。紅景天苷是我國傳統中藥材紅景天中的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，已經被證實能夠減輕過氧化氫所引起的視網膜色素水平細胞損害、缺氧引起的神經元損害、糖基化終末產物引起的內皮損害[6]。本研究將紅景天苷用于高糖引起內皮細胞損傷的干預，通過觀察細胞凋亡情況可知：高糖組的細胞凋亡率明顯高于對照組，而紅景天苷組的細胞凋亡率明顯低于高糖組，提示紅景天苷能夠減輕高糖引起的內皮細胞凋亡。

細胞內線粒體凋亡途徑的過度激活是與高糖、缺氧、氧自由基增多等病理條件引起內皮細胞凋亡密切相關的病理環節[7]。Bax和Bcl-2是線粒體膜上通過改變細胞色素C通透性來調節細胞凋亡的一對分子，Bax能夠通過形成同源二聚體來促進細胞色素C的通透、使線粒體內的細胞色素C大量進入細胞漿并通過激活Caspase-3來介導細胞凋亡[8]；Bcl-2能夠與Bax形成異源二聚體、阻礙細胞色素C的通透，進而抑制細胞色素C對Caspase-3的激活、阻礙細胞凋亡的發生[9]。本研究分析顯示：高糖處理后細胞中Bax、Caspase-3表達增加，Bcl-2表達降低，表明高糖激活了線粒體途徑凋亡；高糖處理的同時加用紅景天苷后，細胞中Bax、Caspase-3表達降低，Bcl-2表達增加，表明紅景天苷能夠抑制高糖條件下內皮細胞中線粒體途徑凋亡的激活。

線粒體途徑凋亡的過度激活是線粒體功能在高糖環境下發生紊亂的表現之一，除此之外，線粒體功能紊亂還會影響氧化呼吸鏈中的電子傳遞發生障礙、游離電子向氧分子轉移并產生氧自由基，進而通過氧自由基介導的氧化應激反應來造成細胞損傷[10]。NOX2和NOX4是NOXs家族中參與內皮細胞線粒體內電子轉移過程的成員，高表達的NOX2和NOX4能促進游離電子及氧自由基的產生，與細胞膜上的脂質發生氧化反應并造成細胞損傷，同時使氧化產物MDA的生成及抗氧化酶SOD及GSH-Px的消耗增多[11]。本研究對高糖條件下HUVEC中以上氧化應激基因及產物的分析顯示：高糖處理后細胞培養基中MDA的含量及NOX2、NOX4的表達水平增加，SOD、GSH-Px的含量降低，表明高糖激活了氧化應激反應；高糖處理的同時加用紅景天苷后，培養基中MDA的含量及NOX2、NOX4的表達水平降低，SOD、GSH-Px的含量增加，表明紅景天苷對高糖誘導內皮細胞中氧化應激反應的激活具有抑制作用。

綜上所述，紅景天苷對高糖條件下血管內皮細胞的凋亡和氧化應激具有抑制作用，未來可進一步通過動物實驗來驗證紅景天苷對糖尿病大鼠內皮功能的保護作用。