犬源H9N2亞型流感病毒的遺傳進化及其致病性分析

曾 昊，何劍橋，崔柏楊，郭嘉寧，郭金凡，周華波，韋祖樟，歐陽康，黃偉堅，陳 櫻*

（1廣西動物疫病預防與控制重點實驗室/廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；2南寧市華波寵物醫院，廣西 南寧 530004）

0 引言

【研究意義】流感病毒（Influenza virus）屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）負股單鏈RNA病毒，依據核蛋白抗原性的不同，可分為A型、B型、C型和D型（Compans et al.，1977；van de Sandt et al.，2015；Asha and Kumar，2019），其中A型流感病毒主要感染野生水禽，并將其作為天然宿主（Webster et al.，1992）。目前已鑒定出18個HA亞型和11個NA亞型的流感病毒（Tong et al.，2013；Zhu et al.，2013），其中H9N2 亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）在我國大部分地區已呈地方性流行，在家禽及一些哺乳動物中以低致病性形式存在，并未引起廣泛關注，但可持續在這些宿主中不斷衍化以適應新宿主，對家禽和哺乳動物的毒力及傳播力也不斷增強。除了衍化成為具有結合人源受體特性和可通過氣溶膠在雪貂間進行傳播外（Wan et al.，2008），H9N2亞型流感病毒還可廣泛承受同個亞型或不同亞型間基因片段的重配，從而產生攜帶不同H9N2亞型譜系片段的新基因型病毒（Su et al.，2015；Li et al.，2017）。犬呼吸道內同時擁有結合人流感和禽流感的受體（Wasik et al.，2017），可作為流感病毒的中間宿主。當2種或多種流感病毒同時存在于犬體內時，不同基因片段的重配會導致新型流感病毒產生。此外，犬作為人類的伴侶動物，在流感病毒的生態循環過程中發揮重要作用，當H9N2亞型流感病毒突破中間宿主屏障時勢必會對人類的健康造成潛在威脅。因此，了解犬源H9N2亞型流感病毒的分子變異特征和致病性，可為揭示H9N2亞型流感病毒突破禽—人宿主屏障的分子機制提供科學依據?！厩叭搜芯窟M展】根據流感病毒8個基因片段的不同來源，Gu等（2014）對H9N2亞型流感病毒建立了一種基因型劃分方法，以BJ/94類譜系的H9N2亞型為A基因型，基因片段來源不同則定義為其他基因型。按照這種劃分方法，我國目前流行的H9N2亞型流感病毒至少可劃分為23種基因型（A～W）（Guan et al.，1999；Gu et al.，2014；Liu et al.，2016）。最初，A基因型在我國H9N2亞型流感病毒中占主導到位，但1998年后H基因型（A基因型的PB2、PB1、PA和NP基因片段由F/98類譜系所替代）逐漸取代A基因型，成為優勢基因型（Liu et al.，2003）。研究表明，F/98類譜系病毒較BJ/94類譜系病毒在雞群中擁有更高的復制和傳播力（Sun et al.，2010），因此H基因型擁有更強的禽類宿主適應能力。2007年出現的S基因型（在H基因型的基礎上替換了G1類譜系的PB2和M基因片段）具有很強的傳播性，可在家禽中穩定傳播，成為目前我國H9N2亞型流感病毒的主要基因型（Gu et al.，2014）。H9N2亞型流感病毒能感染多種哺乳動物，包括犬、貓、雪貂和豬等（Wan et al.，2008；Yu et al.，2008；Sun et al.，2013；Zhou et al.，2015；孔子榮等，2020），更重要的是H9N2亞型流感病毒能跨越宿主感染人類（Sun and Liu，2015；Song and Qin，2020）。此外，H9N2亞型流感病毒可提供病毒基因，導致H5N1亞型流感病毒出現遺傳多樣性（Lei and Shi，2011），同時為H7N7、H5N2、H7N9和H10N8亞型流感病毒提供內部基因，產生新的基因型流感病毒（Li et al.，2014；Xu et al.，2015；Yang et al.，2017）。至今，已有不同亞型流感病毒感染犬的研究報道，如H5N1、H5N2和H9N2亞型AIV，其中H5N1亞型AIV甚至可引起犬死亡（Songserm et al.，2006；Chen et al.，2010，2015；Zhao et al.，2012）。2013年在廣西地區分離獲得犬源H9N2亞型流感病毒，且H9亞型陽性率逐年升高，2012年的檢出率甚至高達44.85%（Sun et al.，2013）。楊新艷等（2012）的犬血清學調查結果顯示遼寧錦州地區犬血清H9亞型病毒陽性檢出率為1.3%；Zhou等（2015）對我國江西、福建、浙江和江蘇地區家禽養殖場附近的流浪犬和流浪貓進行血清學調查，結果發現犬血清中H9亞型病毒陽性檢出率為3.9%，且4.71%的貓血清能與分離獲得的H3N2亞型犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）抗原抗體反應，故推測犬在流感病毒傳播中充當中間宿主的角色。Saberi等（2019）對伊朗東南部地區的犬血清學調查顯示H9N2病毒陽性檢出率為38.23%。此外，Amirsalehy等（2012）在實驗室條件下以H9N2亞型AIV感染犬，結果發現接種組和接觸組犬均出現打噴嚏、咳嗽和流鼻涕等臨床癥狀，且在犬鼻拭子和糞便中均能檢測到病毒存在。Zhang等（2013）進行同樣試驗，但結果顯示僅在肺臟組織中檢測到H9N2亞型AIV，在鼻拭子和咽拭子未檢測到病毒?！颈狙芯壳腥朦c】目前，H9N2亞型流感病毒已在家禽中廣泛流行，但國內外有關H9N2亞型流感病毒感染犬后其分子變異特征及致病性的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過病毒分離鑒定、全基因組擴增及測序，對比分析犬源H9N2亞型流感病毒與H9N2亞型AIV間的遺傳進化關系和關鍵氨基酸位點變化特點，旨在掌握犬源H9N2亞型流感病毒的分子變異特征及致病性，為今后探究流感病毒的禽—犬跨種傳播機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年8月—2019年1月從廣西各地采集流浪犬鼻拭子，共393份。犬腎細胞（Madin-darby caine kidney，MDCK）由廣西疾病預防控制中心惠贈；6周齡SPF級BALB/c雌性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；反轉錄酶、dNTP預混劑和DNA Marker購自TaKaRa公司；核酸提取試劑盒購自Axy-Prep公司；RNA酶抑制劑購自北京全式金生物技術股份有限公司；瓊脂糖凝膠粉末購自生工生物工程（上海）股份有限公司；EB替代染料購自APPLYGEN公司；DMEM液體培養基購自Corning公司；胎牛血清、0.05%胰酶和TPCK胰酶購自Gibco公司；血清白蛋白購自Solarbio公司；細胞板、細胞瓶及吸管等細胞生物耗材購自NEST公司；RT-PCR擴增引物委托上海杰李生物技術有限公司合成。

1.2 樣品檢測及病毒分離

按照核酸提取試劑盒說明提取病毒總RNA，使用通用引物Uni12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）將其反轉錄合成cDNA，利用針對A型流感病毒M基因片段的特異性引物（5'-ATGAGYCTTYTAACCGAGGTC GAAACG-3'和5'-TGGACAAANCGTCTACGCTGC AG-3'）進行PCR擴增。RT-PCR鑒定呈陽性的樣品經0.22 μm除菌濾器過濾后，接種至MDCK細胞，盲傳3代后收集細胞上清液進行鑒定。

1.3 病毒全基因組擴增

使用Hoffmann等（2001）設計的特異性引物擴增分離毒株全基因組。其中，PB2、PB1和PA基因分兩段進行擴增，其余5個基因片段直接擴增。PCR擴增產物經膠回純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 基因序列分析及其遺傳進化分析

使用DNASTAR Lasergene 7.1中的SeqMan對測序結果進行拼接，處理后的全長序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行BLAST同源比對。選用國內外的22株參考毒株，包括主要的H9N2 亞型各譜系代表性毒株BJ/94［A/chicken/Beijing/1/1994（H9N2）］、Y280［A/duck/Hong Kong/Y280/97（H9N2）］、G1［A/quail/Hong Kong/G1/1997（H9N2）］、G9［A/chicken/Hong Kong/G9/1997（H9N2）］、Y439［A/duck/Hong Kong/Y439/1997（H9N2）］、TY/WI/66［A/turkey/Wisconsin/1/1966（H9N2）］、F/98［A/chicken/Shanghai/F/1998（H9N2）］及廣西早期犬源分離毒株GX1［A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）］，采用MEGA 7.0的鄰接法（Neighborjoining）構建系統發育進化樹，Bootstrap設為1000次。

1.5 小鼠致病性試驗

將小鼠隨機平均分為試驗組和對照組，每組9只。采取麻醉滴鼻方式，試驗組每只小鼠接種50 μL病毒液（含1.0×106PFU），對照組每只接種50 μL PBS。從攻毒當天至攻毒后14 d，觀察小鼠臨床癥狀并記錄其體質量，體質量下降25%及以上則默認其死亡（Li et al.，2012；Chen et al.，2015；Mitake et al.，2020），給予安樂死處理。攻毒后第3 d和第5 d每組隨機剖殺3只小鼠，采集腦、上鼻竇、肺臟、肝臟、心臟、腎臟及脾臟組織，通過空斑試驗測定病毒效價。

2 結果與分析

2.1 病毒分離鑒定結果

2017年8月—2019年1月從疑似患流感癥狀［咳嗽、打噴嚏、流鼻涕，以及發熱（體溫＞39 ℃）］的流浪犬中采集393份犬鼻拭子樣品，經RT-PCR檢測顯示有36份樣品呈陽性，陽性率為9.16%。將RT-PCR檢測呈陽性的犬鼻拭子樣品接種至MDCK細胞，結果僅有1份流浪犬樣品接種MDCK細胞后出現皺縮、拉長等明顯病變（圖1-A），而陰性對照孔無明顯變化（圖1-B）。對接種第3代后收集到的細胞上清液進行RT-PCR鑒定，結果擴增獲得約250 bp的目的片段（圖1-C），將該毒株命名為A/canine/Guangxi/LZ11/2018（簡寫為LZ11）。對分離毒株LZ11全基因組進行分段擴增，結果顯示所有擴增片段大小（圖1-D）均與理論值相符。

圖1 犬源流感病毒分離鑒定及其全基因擴增電泳結果Fig.1 Isolation，identification and amplification electrophoresis of complete genome of canine-origin influenza virus

2.2 同源比對分析結果

BLAST同源比對分析結果（表1）表明，分離毒株LZ11的HA、NA基因分別與A/chicken/Hubei/01/2015（H9N2）和A/chicken/JinShui/JS1002/2018（H9N2）對應基因序列的相似性最高，其相似性分別為99.43%和98.33%；而PB2、PB1、M 和NS 基因與H7N9 亞型AIV對應基因序列的相似性最高，達98.55%～99.51%；PA和NP基因則與A/chicken/Anhui/LH99/2017（H9N2）對應基因序列的相似性最高，分別為99.21%和99.53%。

表1 分離毒株LZ11的8個基因片段同源比對分析結果Table 1 Homology comparison of eight gene fragments of LZ11 isolate

2.3 全基因組遺傳進化分析結果

將分離毒株LZ11與國內外22株參考毒株進行遺傳進化分析，結果表明，分離毒株LZ11的HA、NA和NS基因屬于BJ/94類譜系，PB2和M基因屬于G1類譜系，PB1、PA和NP基因屬于F/98類譜系，其中PB1、PA和NP基因節段組成與近年來我國流行的S基因型H9N2亞型AIV一致。分離毒株LZ11的HA、NS、PB2、M、PB1、PA和NP基因片段來源均與廣西早期犬源分離毒株A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）相同（圖2），僅NA基因片段來源不同，分離毒株LZ11的NA基因片段來源于BJ/94類譜系，而A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）的來源于G9類譜系。

圖2 基于H9N2亞型流感病毒8個基因片段相似性構建的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic trees of eight gene fragments based on homology of canine-origin H9N2 subtype influenza virus

2.4 HA、NA和M2蛋白關鍵氨基酸位點分析結果

對分離毒株LZ11與H9N2亞型各譜系代表毒株和廣西早期犬源分離毒株A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）的HA蛋白裂解位點、HA蛋白受體結合位點、NA蛋白耐藥位點及M蛋白耐藥位點進行比較，結果（表2）發現，分離毒株LZ11的HA蛋白在第324～331位存在1個裂解位點（PSRSSR↓GL），符合低致病性流感病毒的特征。與代表毒株相比，分離毒株LZ11的HA蛋白受體結合位點在第153、194、220和228位較保守，但在第183、190、195和226位的變異程度較大，尤其是第226位為亮氨酸（L），使得分離毒株LZ11具有優先結合人類α-2,6唾液酸受體的能力。此外，分離毒株LZ11 的NA 蛋白耐藥位點保持為119E、151D、276E、292R和294N，說明其仍對神經氨酸酶抑制劑敏感；由于分離毒株LZ11的M2蛋白發生31S→N突變，故推測其已對金剛烷胺類藥物產生耐藥性。

表2 分離毒株LZ11與各參考毒株的HA、NA和M2蛋白關鍵氨基酸位點比較Table 2 Comparison of key amino acids sites of HA，NA and M2 proteins in LZ11 isolate and reference strains

2.5 PB2、PB1和PA蛋白關鍵氨基酸位點分析結果

對分離毒株LZ11與H9N2亞型各譜系代表毒株和廣西早期犬源分離毒株A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）的PB2、PB1和PA蛋白進行比較，結果（表3）發現，與H9N2亞型AIV代表毒株相比，分離毒株LZ11的PB1蛋白發生588A→F突變和PA蛋白發生356K→R突變，與其他代表毒株完全不同；但與A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）相比，PB2蛋白292V、PB1蛋白368V和PA蛋白409N并未發生突變，說明分離毒株LZ11保留了部分哺乳動物適應性突變位點，同時其他哺乳動物適應性位點出現新的氨基酸位點突變。

表3 分離毒株LZ11與各參考毒株的PB2、PB1和PA蛋白關鍵氨基酸位點比較Table 3 Comparison of key amino acids sites of PB2，PB1 and PA proteins in LZ11 isolate and reference strains

2.6 小鼠致病性試驗結果

分離毒株LZ11經滴鼻方式接種小鼠后，攻毒組的小鼠未出現死亡現象，也無任何臨床癥狀；僅在攻毒后2 d出現輕微的體質量下降，平均體質量下降4.4%，但至攻毒后3 d小鼠體質量逐漸恢復至正常水平（圖3-A），與對照組小鼠一致。對攻毒組和對照組小鼠的所有臟器進行病毒空斑滴定，結果發現分離毒株LZ11能在攻毒組小鼠的肺臟和上鼻竇組織中進行有效復制，其中攻毒后3 d的肺臟滴度較攻毒后5 d的高，滴度高達3.82 lg PFU/mL，上鼻竇的病毒滴度最高為5.98 lg PFU/mL（圖3-B）。說明分離毒株LZ11能較好地在哺乳動物呼吸道復制。

圖3 小鼠致病性試驗結果Fig.3 Test of pathogenicity in mice

3 討論

H9N2亞型AIV屬于低致病性流感病毒，在家禽中廣泛流行。隨著流感病毒在禽—犬間的不斷傳播，H9N2亞型AIV犬陽性血清不斷被檢出（楊新艷等，2012；Zhou et al.，2015；Saberi et al.，2019），但從犬體內分離獲得H9N2亞型流感病毒并進行致病性分析的研究相對較少。本研究從流浪犬中分離獲得毒株LZ11（A/canine/Guangxi/LZ11/2018）并進行遺傳進化分析，結果表明，分離毒株LZ11的8個基因節段與A/chicken/Anhui/LH99/2017（H9N2）高度同源（99.53%～94.65%），且其基因型是我國當前流行的S基因型（Gu et al.，2014），即分離毒株LZ11為犬源H9N2亞型流感病毒，且屬于近年流行的S基因型。研究發現，2013年感染人類的H7N9亞型AIV是由H9N2亞型AIV提供的內部基因所形成，盡管供體的來源多樣，但均屬于S基因型（Gu et al.，2014；孔子榮等，2020）。值得注意的是，分離毒株LZ11與廣西早期犬源分離毒株A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）的基因型并不一致，A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）來自歐亞類禽譜系AIV的重組H9N2亞型流感病毒（Sun et al.，2013），而分離毒株LZ11是來源于3個譜系的三重組毒株。分離毒株LZ11的NA基因來源于BJ/94類譜系，而A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）來源于G9類譜系，但其余7個基因片段（HA、NS、PB2、M、PB1、PA和NP）的來源相同?？梢姡S著H9N2亞型AIV在家禽中的不斷演化，其主要基因型（S型）正試圖感染新的宿主。犬不僅是流感病毒生態循環過程中的重要中間宿主，還在AIV從禽類跨種感染哺乳動物的傳播過程中發揮重要作用。

為進一步了解分離毒株LZ11的分子變異特征，將其關鍵氨基酸位點與H9N2亞型各譜系代表毒株及廣西早期犬源分離毒株A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）進行比較，結果發現分離毒株LZ11的HA蛋白出現226Q→L突變，具有增強人類SAα2,6Gal受體親和力的分子特征（Teng et al.，2013；Zhou et al.，2015），即具備與人源受體結合的能力。盡管分離毒株LZ11的PB2蛋白保持了627E和701D，但存在292I→V突變。292I→V突變能使病毒擁有更高的病毒聚合酶活性及更強的抑制IFN-β誘導能力，從而增強H9N2亞型流感病毒在哺乳動物宿主體內的復制能力（Gao et al.，2019）。同時有研究表明，PB2蛋白588A→V突變能增加H9N2亞型流感病毒對小鼠的毒力及其在小鼠體內的復制能力（Xiao et al.，2016），但分離毒株LZ11的PB2蛋白588A→F突變是否起到與PB2蛋白588A→V突變相似的作用還有待進一步探究。此外，2株犬源H9N2亞型流感病毒［分離毒株LZ11和A/canine/Guangxi/1/2011（H9N2）］的PB1蛋白均發生368I→V突變。盡管368I→V突變是H5N1亞型AIV在雪貂上的適應性標記，但研究發現該位點在H9N2亞型AIV中逐年增加，從1999年之前的2.8%增加至1999—2012年期間的21.0%，在2013—2019年期間已高達67.0%（Sun et al.，2020）。分離毒株LZ11的PA蛋白還存在356K→R突變，該位點的突變已被證實可提高病毒對小鼠的毒力及其在人類細胞內的復制能力（Xu et al.，2016）。綜上所述，這些哺乳動物適應性位點的突變暗示著犬源H9N2亞型流感病毒可能擁有更強的哺乳動物適應能力。

本研究的小鼠致病性試驗再次驗證了犬源H9N2亞型流感病毒對小鼠的適應能力，雖然對小鼠的致病性不強，但可在小鼠體內較好地復制。李三木等（2021）對廣西早期犬源H9N2亞型流感病毒進行小鼠致病性評估，結果表明犬源H9N2亞型流感病毒對小鼠均未引起死亡，且僅有部分毒株能在小鼠體內有效復制。本研究卻發現分離毒株LZ11感染小鼠3 d后，在肺臟和上鼻竇的病毒滴度分別為3.82和5.98 lg PFU/mL，即病毒復制能力強于廣西早期的犬源分離毒株。但也有研究發現從豬體內分離獲得的H9N2亞型流感病毒可引起小鼠明顯的臨床癥狀，甚至造成死亡（Deng et al.，2010；Wei et al.，2012）。說明不同來源和不同宿主適應后的H9N2亞型流感病毒對小鼠的致病性可能存在差異。對于H9N2亞型AIV跨種感染犬，可能會出現無癥狀感染現象而被忽視，促使其更易獲得適應新宿主的機會，因今后有必要進一步加強對犬源H9N2亞型流感病毒的監測，及早切斷禽—犬傳播，為有效防控流感病毒犬—人跨種傳播打下基礎。

4 結論

分離獲得的犬源H9N2亞型流感病毒屬于近年流行的S基因型，其8個基因節段分屬于3種譜系（BJ/94類譜系、G1類譜系和F/98類譜系），且存在多個哺乳動物適應性相關氨基酸位點突變，具備感染哺乳動物的分子特征，可在小鼠臟器內有效復制。鑒于人類與犬的密切關系，今后應加強對犬源H9N2亞型流感病毒的監測與防控。