3株廣西麻雀源H9N2亞型禽流感病毒對SPF雞的致病性

李 孟，李 丹，謝芝勛，羅思思，謝麗基，張民秀，黃嬌玲，鄧顯文，曾婷婷，阮志華

（廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001）

0 引言

【研究意義】禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是一種具有囊膜的單股負鏈RNA病毒，其基因組由8個不同的獨立片段組成，遺傳不穩定且易發生基因重組和突變（Gu et al.，2017）。近年來，AIV不僅給養禽業造成巨大經濟損失，還跨種傳播引發越來越嚴重的公共衛生問題，已引起人們的廣泛關注（王秀榮和陳化蘭，2015）。野鳥被認為是AIV的天然儲存宿主，從家禽體內分離獲得的AIV均直接或間接來源于野鳥。因此，開展麻雀源H9N2亞型AIV對家禽的感染風險及致病性研究，對科學有效防控禽流感具有重要意義。【前人研究進展】依據病毒表面抗原的不同可將流感病毒劃分為18個HA亞型和11個NA亞型，其中，H1～H16亞型可在野鳥和水禽中分離獲得，而H17N10和H18N11只在南美的蝙蝠體內檢測到（Tong et al.，2013；譚偉和謝芝勛，2015）。H9N2亞型AIV感染雞群主要引起呼吸道、消化道和生殖系統疾病，進而造成雞群生長緩慢及產蛋率下降等不良影響，是目前影響我國養禽業健康發展的主要亞型之一（顧敏等，2015；Li et al.，2017）。此外，H9N2亞型AIV直接感染人類的病例不斷出現，對公共衛生安全已造成一定威脅（Sun et al.，2020）。H9N2亞型AIV于1966年首次分離于美國威斯康星州的火雞群，我國于1994年在廣東省首次報道（陳伯倫等，1994），隨后在國內多個省份暴發流行。王冬冬等（2016）于2010—2014年從山東省發病雞群中分離到1200多株H9N2亞型AIV，其中2013年的病毒分離率高達42.30%；丁園（2019）在2016—2018年從江蘇及周邊地區規模雞場發病雞群中分離獲得50多株H9N2亞型AIV。可見，H9N2亞型AIV已給家禽養殖帶來巨大的經濟損失（顧敏等，2015；Zhu et al.，2018；Li et al.，2019；孫華鵬等，2021）。H9N2亞型AIV在自然界中的宿主范圍十分廣泛（Wang et al.，2016；Ma et al.，2019；Zhang et al.，2020），在野鳥中一般呈隱性感染，且可隨其遷徙及停留在不同國家和地區間進行傳播（蔣文明等，2017；Na et al.，2021）。劉晶（2019）對從不同濕地多種雁形目水鳥中分離獲得的AIV進行遺傳進化分析，結果發現分離株基因與不同遷徙路線上的病毒存在一定程度的基因交流；李玉磊（2020）對從我國主要野鳥棲息地分離到的AIV進行分析，發現其基因來源于北美等候鳥遷徙路線上的多個國家和地區。【本研究切入點】麻雀是一種常見的鳥類，在世界上許多國家廣泛分布，通常成群出現在城市或鄉村的林木上，有時也飛入雞舍等動物飼養場所進行覓食（蘭敏敏等，2018；賈碧云，2019）。麻雀可感染并攜帶AIV，且其群體和數量很大，活動范圍十分廣泛（Han et al.，2012；Broomandet al.，2019），廣西處于候鳥遷徙路線上（Peng et al.，2013；Luo et al.，2017），加之特殊的開放式家禽飼養模式，給麻雀與家禽間創造了更多的接觸機會，進而造成AIV在不同的禽鳥間進行傳播。【擬解決的關鍵問題】明確麻雀源H9N2亞型AIV對雞群的致病性，既有利于了解麻雀在H9N2亞型AIV傳播生態鏈中的作用，對科學防控H9N2亞型AIV的暴發流行也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

毒株A/sparrow/Guangxi/92B7/2014（H9N2）、A/sparrow/Guangxi/130B2/2015（H9N2）、A/sparrow/Guangxi/160B8/2016（H9N2）分別簡稱為SP/GX/92B7/14、SP/GX/130B2/15和SP/GX/160B8/16，由廣西獸醫研究所分離鑒定并保存提供。SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，4周齡SPF雞由廣西獸醫生物技術重點實驗室自行孵化并在專用動物房SPF隔離器內飼養。MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DL2000 DNA Marker、dNTPs和2×PCR Mix購自寶生物工程（北京）有限公司；小量膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；6'-Sialyllactose-PAA-biotin（6'SL-PAA）和3'-Sialyllactose-PAA-biotin（3'SL-PAA）購自GlycoTech公司；RNA抽提試劑盒、快速連接載體試劑盒和TMD底物溶液購自北京全式金生物技術股份有限公司；Streptavidin-HRP購自美國R&D Systems公司；其他試劑均為國產分析純或標準產品。

1.2 麻雀源H9N2亞型AIV的HA基因遺傳進化分析

根據RNA抽提試劑盒說明提取H9N2亞型AIV的RNA，并擴增其HA基因全長；HA基因PCR擴增產物純化后，采用快速載體試劑盒進行連接和克隆轉化，單克隆菌液經PCR鑒定，陽性菌液送至北京六合華大基因科技有限公司測序。測序結果拼接后以MEGA 7.0繪制分離毒株和參考毒株的HA基因系統發育進化樹，同時分析其分子演化及遺傳變異情況。

1.3 麻雀源H9N2亞型AIV受體親和特性測定

根據已測定的病毒HA效價，每株分離毒株用包被緩沖液將其稀釋至7 log2，稀釋好的病毒液按每孔100 μL包被于96孔ELISA酶標板，樣品板置于4 ℃冰箱包被過夜，同時每個樣品均設空白對照孔。參照冉偉等（2013）的方法，將6'SL-PAA及3'SL-PAA唾液酸受體分別設3個不同的稀釋梯度，每個稀釋梯度均設3個重復，當加入終止液反應終止后，用酶標儀在450 nm波長下讀取樣品板中樣品的吸光值。

1.4 雞胚半數感染量（EID50）與雞胚半數致死量（ELD50）測定

根據已測定的病毒HA效價，選取合適的5個稀釋度，以PBS對H9亞型AIV分離株尿囊液進行10倍倍比稀釋，然后接種至10日齡SPF雞胚（0.2 mL/枚），每個稀釋度接種5枚雞胚。接種好的雞胚置于35 ℃溫箱繼續孵育，觀察并記錄24～96 h內的死亡雞胚數，同時收取24～96 h死胚和未死胚的尿囊液，通過HA試驗檢測各樣品效價，然后按照Reed-Muench法分別計算不同毒株的ELD50和EID50。

1.5 麻雀源H9N2亞型AIV對SPF雞的致病性試驗

1.5.1 試驗雞分組及臨床觀察 將84羽4周齡SPF雞隨機均分為4組，其中一組為空白對照組（21羽）；同時將3株不同麻雀源H9N2亞型AIV分離株尿囊液稀釋至106EID50/100 μL，以100 μL稀釋好的病毒液經鼻腔感染剩余3組的SPF雞，每組感染16羽，并于病毒感染24 h后分別在各感染組放入剩余的5羽SPF雞作為空白接觸組，以評估H9N2亞型AIV在雞群中的水平傳播能力。

1.5.2 SPF雞排毒及血清轉陽檢測 于病毒感染后第1、3、5、7、9、11和13 d，分別采集感染組和空白對照組SPF雞的咽喉和泄殖腔棉拭子進行病毒分離，以檢測不同毒株感染SPF雞后的排毒情況。在病毒感染后第14 d采集血樣并分離血清，通過HI試驗檢測血清中的抗體水平，以評價SPF雞血清轉陽情況。病毒感染后連續觀察并記錄各處理組SPF雞的臨床癥狀。

1.5.3 SPF雞剖檢及顯微病變觀察 病毒感染3 d后，各處理組隨機選取3羽SPF雞進行剖殺，觀察其病變并分別采集腎臟、胰腺、腦、肝臟、脾臟、心臟、氣管、胸腺、法氏囊、盲腸扁桃體和肺臟等器官組織，固定后送至廣西中醫藥大學病理教研室制作病理切片。

1.5.4 病毒在SPF雞不同臟器復制情況檢測 病毒感染3 d后，各處理組隨機選取3羽SPF雞進行剖檢，分別采集腎臟、胰腺、腦、肝臟、脾臟、心臟、氣管、胸腺、法氏囊、盲腸扁桃體和肺臟等器官組織，經研磨處理及凍融3次后，接種雞胚進行病毒含量滴定，根據病毒滴定結果判定其在雞不同臟器內的復制情況。

2 結果與分析

2.1 3株麻雀源H9N2亞型AIV的HA基因遺傳進化分析結果

根據構建的HA基因系統發育進化樹（圖1）可知，毒株SP/GX/130B2/15與大多數從家禽中分離獲得的毒株在遺傳進化關系上同屬于Y280/G9大分支，但與常見參考毒株（包括疫苗株SS/SD96/JY）分別歸屬于不同的進化小分支；毒株SP/GX/92B7/14和SP/GX/160B8/16在遺傳進化關系上屬于以A/quail/Hong Kong/G1/97為代表的G1大分支，與現有疫苗株（SS/SD696/JY）的遺傳進化關系較遠。3株麻雀源H9N2亞型AIV在HA蛋白裂解位點處不存在多個堿性氨基酸插入現象，表現為RSSR↓GLF，符合低致病性AIV（LP-AIV）的典型分子特征。毒株SP/GX/92B7/14和SP/GX/160B8/16的HA蛋白氨基酸序列第234位與第236位氨基酸分別為Gln（Q）和Gly（G），僅具有SAα2,3的受體親和特性；毒株SP/GX/130B2/15在上述2個位點均為Leu（L）和Gly（G），具有SAα2,3和SAα2,6的2種受體親和特性。

圖1 3株麻雀源H9N2亞型AIV的HA基因系統發育進化樹Fig.1 Phylogenic tree for HA gene of three H9N2 subtype AIVs from sparrow

2.2 3株麻雀源H9N2亞型AIV受體親和性測定結果

運用ELISA對純化的3株麻雀源H9N2亞型AIV進行受體結合特異性測定，結果表明，毒株SP/GX/92B7/14和SP/GX/160B8/16只具有與SAα2,3受體結合的特性，而毒株SP/GX/130B2/15除了優先選擇與SAα2,3受體結合外，還具有與SAα2,6受體結合的特性。

2.3 3株麻雀源H9N2亞型AIV的雞胚ELD50和EID50

根據Reed-Muench法計算3株麻雀源H9N2亞型AIV的雞胚ELD50和EID50，結果（表1）顯示，3株麻雀源H9N2亞型AIV的EID50在10-6.0/0.2 mL～10-6.8/0.2 mL，ELD50在10-6.8/0.2 mL～10-7.2/0.2 mL。

表1 3株麻雀源H9N2亞型AIV對10日齡SPF雞胚的ELD50和EID50Table 1 ELD50 and EID50 of three H9N2 subtype AIVs from sparrow to 10-day SPF chicken embryos

2.4 3株麻雀源H9N2亞型AIV對SPF雞的致病性

2.4.1 3株麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后的臨床癥狀 與空白對照組相比，3個感染組的SPF雞在感染病毒后21 d內均出現精神沉郁和輕微的呼吸道癥狀，但未出現雞只死亡現象，其結果符合世界動物衛生組織（OIE）關于LP-AIV的臨床判定標準，與HA基因裂解位點的分析結果一致。

2.4.2 3株麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后的排毒及血清轉陽情況 3株H9N2亞型AIV稀釋至106EID50/100 μL對SPF雞進行滴鼻感染，在病毒感染后第1、3、5、7、9、11和13 d進行咽喉和泄殖腔棉拭子采集，再對雞胚增殖后有HA效價的樣品進行統計分析，結果發現各毒株感染SPF雞后的排毒能力存在一定差異（表2）。在3個感染組中，僅毒株SP/GX/92B7/14在感染后的雞泄殖腔棉拭子中未檢測到，咽喉棉拭子也只在感染后第3、5和7 d的少數雞只中檢測到對應的病毒，說明毒株SP/GX/92B7/14感染雞后可能只進行呼吸道排毒且排毒能力不強；毒株SP/GX/130B2/15和SP/GX/160B8/16均能通過咽喉及泄殖腔排毒，且感染第3 d主要通過呼吸道向外排毒，第5和7 d則主要通過消化道向外排毒。病毒檢測結果還發現，3個感染組的雞只均在病毒感染后第7 d基本停止向外排毒，即3株麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后的排毒期主要介于第1～7 d。

表2 3株麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后的排毒及血清轉陽情況Table 2 Detection of detoxification and seroconversion in chickens infected with three H9N2 subtype AIVs from sparrow

病毒感染后第14 d的雞血清抗體水平檢測結果表明，3株麻雀源H9N2亞型AIV不僅能使感染的雞只產生較強抗體，還能使空白接觸組的雞只（除感染SP/GX/130B2/15的雞群僅感染空白接觸組的3/5外，其余試驗組均感染了空白接觸組的全部雞群）產生對應抗體，說明3株麻雀源H9N2亞型AIV不經體內環境適應也可直接感染雞群，且能傳播感染同居的空白雞群，即具備在雞群間水平傳播的能力。可見，麻雀源SP/GX/92B7/14、SP/GX/130B2/15和SP/GX/160B8/16均能不經體內適應而直接感染雞群并排毒。

2.4.3 3株麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后的剖檢病變及組織病理切片觀察結果 在感染病毒后第3 d對感染組和空白對照組的雞只進行解剖，結果發現3個感染組約有2/3的雞分別在氣管和肺臟出現不同程度的充血或出血病變（圖2），但其他臟器均未發現明顯的病變。組織病理切片觀察發現：與空白對照組（圖3-A和圖3-C）相比，3個感染組雞群的腦組織均未出現任何病理損傷，氣管黏膜上皮部分纖毛出現脫落，黏膜下層毛細血管擴張充血且伴隨有部分淋巴細胞浸潤（圖3-B）；肺臟中的肺泡壁增厚且有較多紅細胞滲透到肺泡中，肺間質中有少量淋巴細胞浸潤（圖3-D）；心臟也未發現任何病變和組織損傷；肝臟出現少量的灶狀和點狀壞死；脾臟呈現紅、白髓比例增高，紅髓髓竇擴張充血；腎臟組織僅表現為毒株SP/GX/92B7/14感染后腎間質血管擴張充血，有淋巴細胞浸潤；胸腺、法氏囊及其他組織器官均未出現任何病理變化或組織損傷。說明3株麻雀源H9N2亞型AIV對雞上呼吸道的氣管及肺臟損傷較嚴重。

圖2 麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后氣管和肺臟的病理變化Fig.2 Trachea and lung lesions of SPF chickens infected with H9N2 subtype AIV from sparrow

圖3 麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后氣管和肺臟的組織病理切片觀察結果Fig.3 Histopathologic section observation of trachea and lung of SPF chickens infected with H9N2 subtype AIV from sparrow

2.4.4 3株麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞后不同組織中的病毒復制情況 在滴鼻感染H9N2亞型AIV后第3 d從各感染組雞群中隨機選取3羽進行剖檢，分別采集呼吸系統的氣管和肺臟，免疫系統的胸腺、脾臟、盲腸扁桃體和法氏囊，以及腦、心臟、胰腺和腎臟等器官組織，經研磨處理后接種雞胚進行病毒含量滴定。結果（表3）顯示，3株麻雀源H9N2亞型AIV在SPF雞體內各器官中的復制能力存在一定差異，可在感染雞只的氣管和肺臟中進行有效復制，而在肝臟、腦、胰腺、胸腺、心臟、盲腸扁桃體及法氏囊中均未檢測到對應的病毒。毒株SP/GX/92B7/14感染的個別雞只其腎臟和脾臟中可檢測到對應病毒。

表3 3株麻雀源H9N2亞型AIV在感染雞只各器官組織中的復制情況Table 3 The virus titer of three H9N2 subtype AIVs from sparrow in organs of infected chickens

3 討論

野鳥是H9N2亞型AIV的天然儲存庫，其宿主范圍還在不斷擴大（張靜等，2016；楊勇等，2020），可隨野鳥的遷徙而長距離傳播。AIV監測結果表明，廣西地區的野鳥攜帶有大量H9N2亞型AIV（黃勝斌等，2011；徐倩，2015；李云燕，2020），加之廣西家禽的養殖模式以散養為主，交易方式以活禽市場交易為主，為野鳥與家禽在野外及活禽市場接觸或混居提供了機會，同時為AIV的傳播和變異創造了有利條件（熊文婕等，2018）。疫苗接種仍是當前防控禽流感暴發流行的最有效手段，野鳥帶毒遷徙造成的病毒傳播和疫苗免疫壓力導致的AIV抗原變異，均給H9亞型禽流感防控帶來極大挑戰（劉兆潔，2017；屈孟錦，2019）。前期的AIV廣西分離株遺傳進化分析結果表明，從野鳥和家禽中分離獲得的H9N2亞型AIV歸屬于Y280/G9和G1兩大分支，與目前常用的疫苗株親緣關系較遠（李丹，2017）。本研究選取3株HA基因分別來源于Y280/G9-Like和G1-Like譜系的麻雀源H9N2亞型AIV感染SPF雞，結果表明，3株麻雀源H9N2亞型AIV可直接感染SPF雞，雞群感染后表現出精神沉郁和輕微的呼吸道癥狀，排毒檢測結果證實3株病毒感染雞后可通過呼吸道等途徑向外

排毒，也可水平傳播給同群空白雞。國內已有研究表明，野鳥源（鵪鶉和燕雀等）H9N2亞型AIV均對SPF雞有感染性，且大部分毒株具有在雞群中水平傳播的能力（于揚等，2016；蔣文明等，2017；袁靜，2017）。Guo等（2021）研究發現，5株野鳥源（孔雀、天鵝和野鳥）H9N2亞型AIV感染SPF雞后可在其氣管和肺臟中進行復制，同時具有在雞群水平傳播的能力。此外，張芳等（2015）分離獲得1株對SPF雞無感染性的野鳥源H9N2亞型AIV，但對SPF鴨有感染性且具有在鴨群中水平傳播的能力。可見，野鳥源H9N2亞型AIV可不經體內適應而直接感染家禽，且具有在家禽間水平傳播的能力，對家禽養殖業的健康發展造成了巨大潛在威脅。

由于野鳥源H9N2亞型AIV的HA基因在遺傳進化上與現有疫苗株存在明顯變異，具有在雞群中水平傳播的能力，即這些毒株具有在雞群間大規模暴發流行的潛在可能性。因此，在日常的禽流感防控過程中應加強對麻雀等野鳥源AIV的監測，密切關注對家禽養殖影響較大的H9N2亞型AIV流行趨勢及遺傳變異動態，尤其是加強家禽飼養和流通環節的消毒與防護措施，盡量避免雞、鴨等家禽與野鳥接觸（崔鵬飛等，2016；Jin et al.，2020），切斷AIV在不同野鳥與家禽間的傳播途徑，同時要盡快研發出與當前H9N2亞型AIV抗原性相一致的疫苗，進而減少禽流感暴發造成的經濟損失和公共衛生安全威脅。

4 結論

麻雀源H9N2亞型AIV可直接感染雞群且具有在雞群間水平傳播的潛在風險，提示在家禽飼養、運輸及銷售等環節要做好相關的防護措施，切斷AIV在野鳥與家禽間的傳播途徑，減少禽流感暴發造成的經濟損失。