意大利蜜蜂Ci蛋白的生物信息學分析

王 玨，于點點，郭 媛，郭麗娜

（1山西農業大學動物科學學院，山西 太谷 030801；2山西農業大學園藝學院，山西 太谷 030801）

0 引言

【研究意義】Hedgehog（Hh）信號通路在不同物種間具有一定的保守性，從昆蟲到人類均普遍存在，其主要功能是調節體節形成、胚胎發育及成體組織穩態（王露林等，2021）。Hh信號通路活性的喪失會導致多種人類出生缺陷，包括前腦無裂畸形、多指畸形、顱面缺損和骨骼畸形（Huangfu and Anderson，2006）。在無脊椎動物中，轉錄因子（Cubitus interruptus，Ci）修飾是Hh信號通路轉錄激活前最后一個被識別的步驟。Ci可形成一個截斷的阻遏因子（CiR/Ci75）或基于Hh作為激活因子（CiA/Ci155）調控靶基因表達（Little et al.，2020）。在脊椎動物中，與Ci同源的膠質母細胞瘤（Glioblastomas，Glis）在Hh信號通路調控中發揮著類似且更復雜的作用（Koh et al.，2021）。Hh信號通路在胚胎發育及組織穩態期間參與一系列復雜的過程（Xiong et al.，2015）。因此，了解意大利蜜蜂Ci蛋白基本信息，明確其結構特點及生物學功能，可為揭示Ci蛋白在意大利蜜蜂Hh信號通路中的作用機理和功能提供理論依據。【前人研究進展】Hh信號通路轉導是通過轉錄因子Ci/Gli來實現（Shi et al.，2014）。Ci包含5個典型的鋅指蛋白結構域，具有高度保守性（Jiang，2022）。Ci也是Hh信號通路中唯一的轉錄因子，由1397個氨基酸殘基組成，可被切割成75 kD大小的轉錄抑制因子——CiR，且能同時激活轉錄靶點（Robbins et al.，2012）。Hh信號通路中其他成分蛋白的主要功能是調節Ci的分布及其活性，包括：（1）fu，一種特定的絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶（Maloverjan and Piirsoo，2012）；（2）fu抑制劑［Su（fu）］，與fu和Costal-2（Cos-2）發生物理作用（Oh et al.，2015）；（3）類運動蛋白Cos-2，與微管的高親和性結合被Hh信號通路轉導逆轉（Kalderon，2004）；（4）蛋白激酶A（PKA），其功能發揮需要抑制Hh 信號（Kotani，2012）；（5）CREB-結合蛋白（dCBP），一種被認為能直接與Ci結合的轉錄輔助激活因子（Chen et al.，2000）；（6）Slimb，一種含WD40的F-box蛋白，其功能是切割全長Ci（Smelkinson and Kalderon，2006）；（7）微管蛋白（Cohen，2003）。已有研究表明，在果蠅中Hh信號通路通過Ci發出信號控制幼蟲胚胎表皮細胞命運，細胞間相互作用產生分泌的信號分子成為Hh信號通路表達的一部分，分泌信號分子通常協同作用，進而調節細胞命運（Angelats et al.，2002）。因此，推測Ci蛋白在蜜蜂胚胎發育過程中發揮著控制幼蟲表皮細胞發育的作用。【本研究切入點】Hh信號通路廣泛參與脊椎動物及無脊椎動物的發育過程，但至今尚無針對意大利蜜蜂Ci蛋白結構及功能的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以意大利蜜蜂Ci蛋白為研究對象，利用在線生物信息學工具進行預測分析并闡述其功能，為揭示Ci蛋白在意大利蜜蜂Hh信號通路中的功能和作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

使用NCBI-Smart BLAST檢索Ci蛋白的同源氨基酸序列，包括黑腹果蠅、斑馬魚、小鼠、人類及意大利蜜蜂Ci蛋白序列，均從NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）獲取。

1.2 試驗方法

使用在線生物信學分析軟件（表1）對意大利蜜蜂Ci信息數據庫進行結構和功能預測分析，包括ProtParam、SignalP-5.0、SoftBerry等。

表1 在線生物信息學分析軟件Table 1 Online software of bioinformatic and phylogenetic analysis

2 結果與分析

2.1 意大利蜜蜂Ci蛋白理化性質分析結果

利用ProtParam對意大利蜜蜂Ci蛋白進行理化性質分析，結果顯示：意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型的開放閱讀框（ORF）為4338 bp，編碼1445個氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為15.50 kD，理論等電點（pI）為8.39；包含20種常見的氨基酸，其中脯氨酸（Pro）含量最高（占11.2%）、色氨酸（Trp）含量最低（占0.5%）；蛋白分子結構為C6586H10266N2056O2123S86，脂溶指數為49.51，總平均親水性為-0.806（屬于親水性蛋白），不穩定系數為65.85（蛋白穩定參數＜40為穩定蛋白質）。意大利蜜蜂Ci蛋白XP_006558245.2亞型的ORF為3873 bp，編碼1290個氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為13.99 kD，pI為8.48；包含20種常見的氨基酸，其中絲氨酸（Ser）含量最高（占11.4%）、Trp含量最低（占0.5%）；蛋白分子結構為C5909H9293N1849O1932S85，脂溶指數為50.26，總平均親水性為-0.849（屬于親水性蛋白），不穩定系數為66.77。由于意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型的不穩定系數均大于40，故推測意大利蜜蜂Ci為不穩定蛋白。

2.2 意大利蜜蜂Ci蛋白信號肽及亞細胞定位預測結果

利用SignalP-5.0對意大利蜜蜂Ci蛋白進行信號肽預測，結果顯示，Ci蛋白XP_624136.4亞型和XP_006558245.2亞型的第1～20位氨基酸殘基間無信號肽（圖1），也無跨膜結構（圖2），不屬于膜蛋白。以在線網站http://linux1.softberry.com/all.htm蛋白數據庫為基礎，對意大利蜜蜂Ci蛋白進行亞細胞定位預測，發現Ci蛋白XP_624136.4亞型主要定位于細胞核（占91.3%），在囊細胞質中有少量分布（占8.7%）；Ci蛋白XP_006558245.2亞型主要定位于細胞核（占87.0%），8.7%位于囊細胞質中，在線粒體中也有少量分布（占4.3%），表明意大利蜜蜂Ci參與維持蛋白完整性。

圖1 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）信號肽預測結果Fig.1 Signal peptide prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

圖2 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）跨膜結構預測結果Fig.2 Transmembrane structure prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

2.3 意大利蜜蜂Ci蛋白糖基化位點、磷酸化位點和蘇木素化位點預測結果

分別利用NetOGlyc 3.1和NetPhos 3.1對意大利蜜蜂Ci蛋白的O-糖基化位點、N-糖基化位點和磷酸化位點進行預測，結果發現：Ci蛋白XP_624136.4亞型3Thr（0.519）和248Thr（0.542）的2個O-糖基化位點均高于閾值0.50，說明其存在2個O-糖基化位點（圖3）；Ci蛋白XP_006558245.2亞型12Thr、39Thr、189Thr、205Thr、228Thr、244Thr、246Thr、251Thr、252Thr、256Thr、469Thr、640Thr、669Thr、682Thr、692Thr、707Thr、714Thr、841Thr、851Thr、863Thr、893Thr、929Thr、1070Thr、1113Thr、1246Thr和1273Thr的26個O-糖基化位點均高于閾值0.50，即存在26個O-糖基化位點（圖3）。Ci蛋白XP_624136.4亞型預測到127Thr（0.741）、171Thr（0.618）、255Thr（0.642）、402Thr（0.604）、550Thr（0.664）、790Thr（0.543）、871Thr（0.504）、1133Thr（0.593）和1402Thr（0.615）共9個N-糖基化位點（圖4），XP_006558245.2亞型預測到16Thr（0.638）、100Thr（0.659）、247Thr（0.618）、395Thr（0.679）、635Thr（0.557）、716Thr（0.515）、978Thr（0.614）和1247Thr（0.618）共8 個N-糖基化位點（圖4）。

圖3 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）O-糖基化位點預測結果Fig.3 O-glycosylation site prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

圖4 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）N-糖基化位點預測結果Fig.4 N-glycosylation site prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型存在174個磷酸化位點，其中，磷酸絲氨酸位點127個（88Ser、89Ser、90Ser、110Ser、130Ser、138Ser、142Ser、166Ser、169Ser、173Ser、197Ser、203Ser、209Ser、210Ser、214Ser、218Ser、223Ser、229Ser、230Ser、231Ser、234Ser、241Ser、246Ser、249Ser、252Ser、257Ser、259Ser、260Ser、261Ser、263Ser、265Ser、274Ser、330Ser、333Ser、343Ser、362Ser、365Ser、370Ser、372Ser、376Ser、384Ser、385Ser、389Ser、417Ser、419Ser、464Ser、473Ser、510Ser、521Ser、536Ser、543Ser、554Ser、574Ser、575Ser、604Ser、613Ser、615Ser、617Ser、626Ser、628Ser、629Ser、631Ser、634Ser、636Ser、640Ser、643Ser、650Ser、703Ser、714Ser、733Ser、736Ser、766Ser、771Ser、773Ser、783Ser、789Ser、791Ser、794Ser、799Ser、802Ser、807Ser、810Ser、811Ser、814Ser、817Ser、828Ser、834Ser、838Ser、841Ser、842Ser、845Ser、848Ser、861Ser、863Ser、873Ser、901Ser、913Ser、922Ser、973Ser、980Ser、1011Ser、1026Ser、1033Ser、1034Ser、1041Ser、1060Ser、1068Ser、1071Ser、1076Ser、1085Ser、1176Ser、1192Ser、1221Ser、1235Ser、1239Ser、1292Ser、1296Ser、1360Ser、1362Ser、1366Ser、1378Ser、1393Ser、1406Ser、1411Ser、1430Ser、1432Ser和1433Ser），磷酸蘇氨酸位點32個（145Thr、167Thr、194Thr、344Thr、348Thr、373Thr、374Thr、383Thr、388Thr、390Thr、399Thr、400Thr、405Thr、406Thr、407Thr、432Thr、445Thr、493Thr、517Thr、552Tyr、567Thr、624Thr、667Thr、740Thr、770Tyr、795Tyr、824Tyr、837Thr、846Thr、847Thr、869Thr和909Tyr），磷 酸 色 氨酸位點15個（8Tyr、233Tyr、559Tyr、570Tyr、589Tyr、797Tyr、1020Tyr、1028Tyr、1043Tyr、1121Tyr、1331Tyr、1343Tyr、1379Tyr、1385Tyr和1440Tyr）（圖5）。Ci 蛋 白XP_006558245.2 亞 型 存 在156個磷酸化位點，其中，磷酸絲氨酸位點120個（11Ser、14Ser、18Ser、42Ser、48Ser、54Ser、55Ser、59Ser、63Ser、68Ser、74Ser、75Ser、76Ser、79Ser、86Ser、91Ser、94Ser、97Ser、102Ser、104Se、105Ser、106Ser、108Ser、110Ser、119Ser、175Ser、178Ser、188Ser、207Ser、210Ser、215Ser、217Ser、221Ser、229Ser、230Ser、234Ser、262Ser、264Ser、309Ser、318Ser、355Ser、366Ser、381Ser、388Ser、399Ser、419Ser、420Ser、449Ser、458Ser、460Ser、462Ser、471Ser、473Ser、474Ser、476Ser、479Ser、481Ser、485Ser、488Ser、495Ser、548Ser、559Ser、578Ser、581Ser、611Ser、616Ser、618Ser、628Ser、634Ser、636Ser、639Ser、644Ser、647Ser、652Ser、655Ser、656Ser、659Ser、662Ser、673Ser、679Ser、683Ser、686Ser、687Ser、690Ser、693Ser、706Ser、708Ser、718Ser、746Ser、758Ser、767Ser、818Ser、825Ser、856Ser、871Ser、878Ser、879Ser、886Ser、905Ser、913Ser、916Ser、921Ser、930Ser、1021Ser、1037Ser、1066Ser、1080Ser、1084Ser、1137Ser、1141Ser、1205Ser、1207Ser、1211Ser、1223Ser、1238Ser、1251Ser、1256Ser、1275Ser、1277Ser和1278Ser），磷酸蘇氨酸位點29個（12Thr、193Thr、219Thr、228Thr、245Thr、250Thr、252Thr、277Thr、290Thr、362Thr、412Thr、512Thr、585Thr、615Thr、640Thr、669Thr、682Thr、691Thr、692Thr、714Thr、841Thr、929Thr、953Thr、1004Thr、1041Thr、1056Thr、1071Thr、1113Thr和1252Thr），磷酸色氨酸位點7個（404Tyr、642Tyr、966Tyr、1176Tyr、1224Tyr、1230Tyr和1285Tyr）（圖5）。

圖5 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）磷酸化位點預測結果Fig.5 Phosphorylation site prediction of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型存在5個易發生蘇木素化的修飾位點（Score＞0.5），分別是642K（0.93）、398K（0.93）、770K（0.91）、1388K（0.84）和364K（0.61）（圖6）；XP_006558245.2亞型也存在5個易發生蘇木素化的修飾位點，分別是484K（0.93）、241K（0.93）、613K（0.91）、1231K（0.84）和206K（0.61）（圖7）。

圖6 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型蘇木素化位點預測結果Fig.6 Sumolation site prediction of XP_624136.4 subtype of Ci proteins in A.mellifera

圖7 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_006558245.2亞型蘇木素化位點預測結果Fig.7 Sumolation site prediction of XP_006558245.2 subtype of Ci proteins in A.mellifera

2.4 意大利蜜蜂Ci蛋白高級結構預測結果

蛋白多肽鏈在各種二級結構的基礎上進一步盤曲或折疊形成具有一定規律的三維空間結構，蛋白三級結構的穩定性主要靠次級鍵，包括氫鍵、疏水鍵、鹽鍵及范德華力等（羅鈞文，2022）。采用GOR4預測意大利蜜蜂Ci蛋白二級結構，結果（圖8）顯示，XP_624136.4亞型二級結構中α-螺旋占13.49%（195個氨基酸殘基）、延伸鏈占15.22%（220個氨基酸殘基）、無規則卷曲占71.28%（1030個氨基酸殘基）；XP_006558245.2亞型二級結構中α-螺旋占11.47%（148個氨基酸殘基）、延伸鏈占15.58%（201個氨基酸殘基）、無規則卷曲占72.95%（941個氨基酸殘基）。

圖8 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（上）和XP_006558245.2亞型（下）二級結構預測結果Fig.8 Secondary structure prediction of XP_624136.4 subtype（up）and XP_006558245.2 subtype（down）of Ci proteins in A.mellifera

通過NCBI的CD-Search軟件，輸入Ci氨基酸序列即獲得該蛋白的模體預測結果。意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型均擁有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結構域（圖9），只是所處位點不同，說明該蛋白屬于SPF1家族。通過SWISS-MODEL預測意大利蜜蜂Ci蛋白三級結構，結果表明，GMQE為0.07，QMEAN為0.67，蛋白氨基酸序列與2Gli.1.C模板序列具有高度相似性，相似性為81.94%，說明該模型具有相對合理的結構，且2個亞型選取的合適模型相同。意大利蜜蜂Ci蛋白三級結構中無規則卷曲分布較多（圖10），此類結構對生物學功能的發揮具有重要作用。

圖9 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（上）和XP_006558245.2亞型（下）模體結構預測結果Fig.9 Motif structure prediction XP_624136.4 subtype（up）and XP_006558245.2 subtype（down）of Ci proteins in A.mellifera

圖10 意大利蜜蜂Ci蛋白三級結構預測結果Fig.10 Tertiary structure prediction of Ci proteins in A. mellifera

基于意大利蜜蜂Ci蛋白三級結構構象和同源蛋白相似性波形圖，進一步對預測模型的可靠性進行驗證，采用The Structure Analysis and Verification Server對預測模型進行拉曼圖分析，結果發現意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型均顯示預測的蛋白殘基二面角位于黃色核心區域（圖11）。該區域構象是立體化學允許區，可穩定存在，說明該模型的構象符合立體化學規則。

圖11 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（左）和XP_006558245.2亞型（右）三級結構模型拉曼圖Fig.11 Ramachandran map of tertiary structure predication of XP_624136.4 subtype（left）and XP_006558245.2 subtype（right）of Ci proteins in A.mellifera

2.5 意大利蜜蜂Ci蛋白結構域與物種同源性分析結果

通過SMART對意大利蜜蜂Ci蛋白保守結構域進行預測，結果發現意大利蜜蜂Ci蛋白具有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結構域（圖12）。XP_624136.4亞型的C2H2型鋅指蛋白結構域分別位于第432～457位、第465～492位、第498～522位、第528～553位和第559～584位氨基酸殘基處，能與DNA結合而激活靶蛋白轉錄；還有13個低復雜性區域，分別位于第17～86位、第88～132位、第214～231位、第251～272位、第284～333位、第396～411位、第593～613位、第626～640位、第704～712位、第836～851位、第913～922位、第1256～1272 位 和 第1310～1321 位 氨 基 酸 殘 基 處。XP_006558245.2亞型的C2H2型鋅指蛋白結構域分別位于第277～302位、第310～337位、第343～367位、第373～398位和第404～429位氨基酸殘基處；還有11個低復雜性區域，分別位于第59～76位、第96～117位、第129～178位、第241～256位、第438～458位、第471～485位、第549～557位、第681～696位、第758～767位、第1101～1117位和第1155～1166位氨基酸殘基處。

圖12 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型（上）和XP_006558245.2亞型（下）保守結構域預測結果Fig.12 Conserved domain prediction of XP_624136.4 subtype（up）and XP_006558245.2 subtype（down）of Ci proteins in A.mellifera

使用NCBI的BLAST 檢索Ci蛋白同源氨基酸序列，結果顯示，意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型與黑腹果蠅A型和B型及小鼠、人類、斑馬魚具有較高的氨基酸序列相似性，對應的相似性分別為59%、57%、51%、47%和31%（圖13）；XP_006558245.2亞型與黑腹果蠅A型和B型的氨基酸序列相似度均為64%，與小鼠、人類、斑馬魚的氨基酸序列相似性分別為58%、52%和34%（圖14）。同時以DNAMAN對意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型氨基酸序列進行對比，并使用MEGA 11.0構建系統發育進化樹，結果顯示在昆蟲中意大利蜜蜂Ci蛋白的2條氨基酸序列均與黑腹果蠅A型的親緣關系較近（圖15），即意大利蜜蜂Ci蛋白在昆蟲到哺乳動物間的保守性較高，與多重序列比對結果一致。

圖13 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型與其他物種Ci氨基酸序列的比對分析結果Fig.13 Alignment of amino acid sequences of XP_624136.4 subtype of Ci proteins in A.mellifera sequence with Ci amino acid sequences in other species

圖14 意大利蜜蜂Ci蛋白XP_006558245.2亞型與其他物種Ci氨基酸序列的比對分析結果Fig.14 Alignment of amino acid sequences of XP_006558245.2 subtype of Ci proteins in A.mellifera sequence with Ci amino acid sequences in other species

圖15 基于Ci蛋白氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹Fig.15 Phylogenetic tree based on Ci protein amino acid sequence similarity

2.6 意大利蜜蜂Ci蛋白的互作蛋白預測結果

通過String數據庫預測分析與意大利蜜蜂Ci蛋白發生相互作用的蛋白，結果發現意大利蜜蜂Ci蛋白2個亞型的序列構象相同，均與kinesin-B、Ptc、Poz、Su（fu）、slmb、smo、Csnk1a1、cul-3和fu等驅動蛋白樣蛋白（Kines in family member）形成相互作用網絡（圖16）。

圖16 意大利蜜蜂Ci蛋白的互作蛋白網絡Fig.16 Interacting protein network of Ci proteins in A. mellifera

3 討論

Hh信號通路對脊椎動物和無脊椎動物的發育至關重要（Liu，2019），但目前鮮見針對Hh信號通路中Ci蛋白的相關研究報道。本研究通過探析意大利蜜蜂Ci蛋白的基本生物學信息，發現意大利蜜蜂Ci蛋白屬于不穩定的兩性蛋白（總平均親水性在-0.5～0.5時為兩性蛋白），無信號肽，無跨膜結構，具有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結構域，能與DNA結合而激活靶蛋白轉錄，與Hh信號通路中Suppressor of Fused與Gli/Ci蛋白復合物的結構及功能研究結果（張燕，2014）一致；亞細胞定位預測發現，意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型定位在細胞核及囊細胞質中，XP_006558245.2亞型定位于細胞核、囊細胞質和線粒體中，與Wang和Holmgren（2000）報道的果蠅Ci蛋白僅定位于細胞核的研究結論有所不同，說明意大利蜜蜂Ci參與維持細胞正常形態，具有運輸及結合的作用。Hh蛋白通過與Patched受體結合，激活Smoothened蛋白（smo），并最終改變Gli/Ci家族蛋白的轉錄活性（Zhou and Kalderon，2010），即Hh信號輸出的決定因素是Gli/Ci轉錄因子活性（Pan et al.，2017）。

蛋白翻譯后修飾通過功能基團或蛋白的共價添加、調節亞基蛋白水解切割或整個蛋白降解來增加蛋白組功能多樣性，包括磷酸化、糖基化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙酰化、脂質化和蛋白水解，幾乎影響正常細胞生物學及發病機制的所有過程（Jiang，2022）。蛋白磷酸化是調節和控制蛋白活力與功能最基本、最普遍、最重要的作用機制（Lee et al.，2019），同時調節多種細胞過程，如基因表達、代謝、細胞周期調節、分化及凋亡（Cohen，2002）。蛋白糖基化是翻譯后最常見、最復雜的修飾之一，不僅極大地促進生物體蛋白組的擴展，超出基因組編碼范圍，還對蛋白的功能、穩定性、亞細胞定位等有重要影響（Eichler，2019）。蘇木素化能調節細胞過程，如核運輸、轉錄、染色體分離和DNA修復等（Gareau and Lima，2010），其發揮的具體作用包括改變底物與DNA、RNA或其他蛋白的相互作用，改變蛋白構象或酶活性，以及調節其他修飾（Flotho and Melchior，2013）。本研究結果表明，意大利蜜蜂Ci蛋白XP_624136.4亞型存在2個O-糖基化位點、174個磷酸化位點及5個蘇木素化位點，XP_006558245.2亞型存在26個O-糖基化位點、156個磷酸化位點及5個蘇木素化位點。雖然意大利蜜蜂Ci蛋白為不穩定蛋白，但磷酸化、糖基化和蘇木素化促使Ci蛋白變得穩定，在細胞發育、細胞間信號傳遞及神經細胞功能調節等生物學功能中發揮重要的調節作用。

基于Ci蛋白氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹顯示，從昆蟲到哺乳動物Ci蛋白序列高度保守。意大利蜜蜂Ci蛋白二級結構中無規則卷曲、延伸鏈分布較多，α-螺旋分布較少，其三級結構中長鏈卷曲較多；同時意大利蜜蜂Ci蛋白與kinesin-B、Ptc、Poz、Su（fu）、slmb、smo、Csnk1a1、cul-3和fu等驅動蛋白樣蛋白形成相互作用網絡。已有研究表明，介導Ci 轉錄的Hh 蛋白可結合到十二通道跨膜受體Patched蛋白（Ptc）上，從而解除Ptc介導的smo抑制七通道跨膜蛋白（Han et al.，2019）；激活的smo又反向進行一系列復雜過程，包括抑制Ci抑制因子的加工及翻譯后修飾，促進全長Ci在細胞質中積累與激活（Lum and Beachy，2004；Jiang and Hui，2008），最終全長Ci激活因子移位進入細胞核并刺激Hh靶蛋白表達，這些靶蛋白在細胞命運的進一步規范中發揮作用。Gli/Ci蛋白家族由多個結構域組成，含有不同的蛋白基序及其行使功能的相關修飾位點；而Ci/Gli轉錄因子的穩定性調控是調節Hh信號活性的重要途徑（周紫章，2015）。由此可見，意大利蜜蜂Ci蛋白在生長發育、跨膜運輸、突觸傳遞、信號轉導和蛋白生成過程中發揮重要作用。

4 結論

意大利蜜蜂Ci蛋白屬于不穩定的兩性蛋白，主要定位于細胞核中，少量分布在囊細胞質或線粒體中，具有5個典型的C2H2型鋅指蛋白結構域，蛋白序列高度保守，在意大利蜜蜂Hh信號通路中主要承擔轉錄功能，對意大利蜜蜂的生長發育、跨膜運輸、突觸傳遞、信號轉導及蛋白生成等起重要調控作用。