1株白魔芋軟腐病病原菌鑒定及其室內藥劑篩選

羅林麗，趙興麗，周羅娜，賀圣凌，劉思睿，張 欣，羅 可，周玉鋒

（1貴州省農業科學院生物技術研究所, 貴州 貴陽 550006；2貴州省農業生物技術重點實驗室，貴州 貴陽 550006；3貴州省農業科學院茶葉研究所, 貴州 貴陽 550006）

0 引言

【研究意義】魔芋（Amorphophallus）是天南星科魔芋屬多年生草本植物的總稱，栽培學上屬薯芋類作物，葡甘聚糖型魔芋是目前發現的僅有幾種能合成葡甘露聚糖（Konjac glucomannan，KGM）的經濟作物之一（劉佩瑛，2004；代雪鳳等，2021）。魔芋KGM因獨特的理化特性已被廣泛用于食品、醫療、日用化工和農業等領域，具有廣闊的市場前景（Yuan et al.，2018；Zhang et al.，2018；李嘉欣等，2020；Du et al.，2021；夏玉婷等，2022）。白魔芋（A.albus）為我國特有種，自然分布于四川南部和云南北部的金沙江干熱河谷地區（劉佩瑛，2004），與傳統種植的花魔芋（A.konjac）和珠芽魔芋（A.bulbifer）相比，白魔芋在KGM含量和品質上更具優勢，且因其在耐熱性、抗病性、抗褐變等方面強于花魔芋和珠芽魔芋，所以近年來被引種到貴州、湖北、云南、重慶等地（劉二喜，2016）。近年來，隨著魔芋市場需求的不斷增長，魔芋人工種植呈現規模化，魔芋病害也越來越嚴重，軟腐病、根腐病等多種病害嚴重制約著魔芋產量的提高，其中以魔芋軟腐病最嚴重。魔芋軟腐病是一種細菌性病害，其侵染性強，魔芋整個生活周期均可染病，該病害傳播快、防治難，迄今為止尚無特效防治方法（徐佳欣等，2018）。因此，明確魔芋軟腐病病原的種類，并針對性地開展藥劑篩選，對魔芋軟腐病的田間防控具有重要意義。【前人研究進展】已報道的魔芋軟腐病病原主要是果膠桿菌屬（Pectobacterium）和迪基氏菌屬（Dickyeya）菌株。最早的研究認為魔芋軟腐病病原菌為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種［Erwinia carotovorasubsp.carotovora，后更名為胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種（P.carotovorumsubsp.carotovorum）］，該菌株會因宿主作物的不同而表現出不同強弱的致病力（沈業壽和儲蘇，2002；劉佩瑛，2004）。隨著分子生物學的發展，相關研究在形態和生理生化分析的基礎上，結合16S～23S rDNA轉錄間隔區的序列分析鑒定花魔芋軟腐病的病原菌主要是胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種和菊果膠桿菌［P.chrysanthemi，后被更名為菊迪基氏菌（D.chrysanthemi）］2種（修建華等，2006；王健等，2009；Wu et al.，2011；孫苗苗，2019；Sun et al.，2019）。近年又發現了其他的魔芋軟腐病病原，魏環宇等（2020）基于形態學觀察和生理生化及16S rDNA序列分析，將從云南珠芽魔芋分離到的軟腐病致病菌鑒定為環狀果膠桿菌（P.aroidearum）；Wei等（2020）首次報道環狀果膠桿菌引起花魔芋軟腐病；崔雙等（2021）從云南魔芋產區的發病植株中分離到3株魔芋軟腐病致病菌，通過形態、致病性和分子特征分析鑒定3株菌株均為環狀果膠桿菌；李珩珺（2021）分別從患病的珠芽魔芋和花魔芋中分離軟腐病菌，經形態學觀察和16S rDNA鑒定確定環狀果膠桿菌為花魔芋的致病菌，而導致珠芽魔芋患軟腐病的是一株未知菌株，尚未確定。在生產實踐中，魔芋軟腐病的防治存在一定困難，通過合理密植、輪作、間套作等栽培措施，可在一定程度上降低發病率。實際生產中魔芋軟腐病防治主要依賴化學藥劑，但多選用廣譜殺菌劑，存在一定盲目性，常用藥劑有各種含銅制劑、異氰尿酸類殺菌劑、噻唑類等（古洪輝等，2018；王紅巖等，2019）。李江濤（2014）研究表明72%農用硫酸鏈霉素灌根處理對魔芋軟腐病的防治效果達89%。和積飛（2018）通過田間藥效試驗發現20%葉枯唑可濕性粉劑和20%噻菌銅懸浮劑對魔芋軟腐病的防治效果優于72%硫酸鏈霉素可溶性粉劑和53.8%氫氧化銅水分散粒劑。【本研究切入點】本課題組在前期的調查中發現貴州省興義市安龍縣白魔芋種植基地出現了一種細菌性病害，而白魔芋一直被認為是抗病性較強的品種，目前未見白魔芋軟腐病方面的研究報道，因此有必要開展白魔芋軟腐病病原菌鑒定和防治藥劑篩選工作。【擬解決的關鍵問題】采用平板劃線分離法對白魔芋軟腐病病原菌進行分離純化，結合形態、致病性和分子生物學分析鑒定病原菌種類，并探究13種殺菌劑對病原菌的室內抑制活性，以期為白魔芋軟腐病田間防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病樣來源 病樣于2020年6月采自貴州省興義市安龍縣白魔芋種植基地發生軟腐病的田塊。

1.1.2 培養基 NA培養基：牛肉浸膏3.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖2.5 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.0。LB固體培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.0；LB液體培養基不加瓊脂。

1.1.3 供試藥劑 室內抑菌試驗的供試藥劑見表1。

表1 供試藥劑Table 1 Experimental reagents

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離純化 利用平板劃線分離法分離病原菌（林可竟等，2021）。取發病白魔芋植株莖部組織的病健交界處切成小塊，利用75%醫用酒精進行表面消毒2 min，用無菌去離子水漂洗3次，隨后將病樣組織置于盛有1 mL無菌水的10 mL離心管中搗碎，使病樣組織中的細菌流出，制成細菌懸浮液，利用無菌接種環取細菌懸浮液在NA培養基上劃線，置于28 ℃培養24 h，根據菌落的形態特征，繼續挑取單菌落進行純化培養，轉接純化3次后的純培養物于4 ℃保存備用。

1.2.2 致病性測定 將分離得到的菌株接種于LB液體培養基中，于28 ℃下180 r/min培養24 h，得到菌懸液。分別對健康白魔芋盆栽植株和新鮮健康白魔芋球莖進行人工接種，接種前用75%醫用酒精對魔芋植株接種莖干和球莖表面擦拭消毒，晾干后用無菌針刺傷魔芋莖干和球莖的表皮層，然后取10 μL菌懸液接種到針刺傷的傷口處，每天觀察記錄發病情況，設接種無菌水為對照。從接種發病的魔芋莖干和球莖組織中重新分離病原菌，利用柯赫氏法則對病原菌進行驗證。

1.2.3 病原菌形態觀察 觀察并記錄病原菌株在LB固體培養基上的菌落形態特征，在掃描電子顯微鏡觀察病原菌的形態特征、菌落形狀、大小等。

1.2.4 分子生物學鑒定 將2次分離得到的病原菌菌株接種于LB液體培養基中，28 ℃下200 r/min培養24 h，利用細菌基因組DNA提取試劑盒DP302［天根生化科技（北京）有限公司］提取菌株的總DNA。采用16S rDNA的通用引物27F/1492R（Osborne et al.，2005）對病原菌菌株的基因組進行PCR擴增，擴增酶為PrimeSTAR?HS DNA Polymerase（TaKaRa公司）。PCR產物電泳檢測后送北京擎科新業生物技術有限公司進行序列測定。測序結果經校驗后提交GenBank數據庫，并利用MEGA 6.06構建系統發育進化樹。

1.2.5 殺菌劑對病原菌的室內抑菌試驗 參照馮迪南等（2018）采用抑菌圈法開展不同殺菌劑對病原菌的抑菌試驗。將病原菌單菌落接種于50 mL LB液體培養基中，28 ℃下200 r/min搖床培養24 h，調整OD600約為0.5，同時將LB固體培養基高溫高壓滅菌后冷卻至50 ℃左右，每100 mL加入1 mL病原菌菌液，充分混勻后倒入90 mm無菌培養皿中，制成每皿20 mL的含魔芋軟腐病病原菌的LB平板，待含菌LB平板凝固后，用5 mm打孔器在平板上打孔，并在孔內加入50 μL殺菌劑，每個藥劑濃度3次重復，以無菌水作對照。28 ℃培養20 h后，測量抑菌圈直徑，并計算殺菌劑對病原菌生長的抑制率。抑制率（%）=（處理組抑菌直徑-對照組抑菌直徑）/處理組抑菌直徑×100。針對有抑菌效果的殺菌劑，在DPS 7.05進行一元回歸分析，以殺菌劑的有效成分濃度的對數為自變量x，對應的抑制率的幾率值為因變量y，得到毒力回歸方程，并比較不同殺菌劑的抑制中濃度（EC50）和相關系數（r）。

1.3 統計分析

利用DPS 7.05對室內毒力測定的試驗數據進行方差分析，采用Duncan’s新復極差法比較各藥劑在不同濃度下的抑制率，進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 田間病害特征

田間調查發現，白魔芋軟腐病多發生在植株莖干部位，整個生長期均可發病，病害初期在莖干上出現小面積的水漬狀斑點，病斑會不斷擴大導致莖干部組織腐爛，有汁液流出，伴隨有臭味，最終導致整株倒伏（圖1）。

圖1 白魔芋軟腐病的發病癥狀Fig.1 Symptoms of soft rot on A.albus

2.2 病原菌分離與鑒定結果

2.2.1 病原菌的分離與致病性驗證 從采集的白魔芋病樣組織中共分離得到6株菌株。取分離得到的菌株分別對健康白魔芋盆栽植株和新鮮健康白魔芋球莖進行人工接種，其中僅有菌株XYmy-A1對白魔芋產生病癥。將菌株XYmy-A1回接到魔芋植株的莖干上，48 h開始出現水漬狀斑點，隨后不斷擴大，第6 d整株倒伏（圖2-A）；將菌株XYmy-A1接種到刺傷的白魔芋球莖表面，48 h后接種部位出現輕微水漬狀，隨后開始腐爛、變軟，腐爛部位不斷擴大，并伴有惡臭味，將球莖切開可看到膿狀的腐爛組織（圖2-C-1和圖2-C-2）；對照組均無癥狀（圖2-B和圖2-D），說明菌株XYmy-A1在白魔芋莖部和球莖部均可致病。發病后從發病組織上重新分離的菌株與接種菌株XYmy-A1一致，說明該菌株為白魔芋軟腐病的病原菌。

圖2 白魔芋植株和球莖接種菌株XYmy-A1后的軟腐病病癥Fig.2 Soft rot symptoms on A.albus plants and corms after inoculation with strain XYmy-A1

2.2.2 菌株XYmy-A1的形態特征 菌株XYmy-A1在LB固體培養基上為乳白色的菌落，菌落表面光滑，中間隆起（圖3-A），革蘭氏染色為陰性（圖3-B）。掃描電鏡下觀察，菌株XYmy-A1呈短桿狀，兩頭鈍圓，具有多根鞭毛（圖3-C）。

圖3 菌株XYmy-A1的形態Fig.3 Morphological characteristics of strain XYmy-A1

2.2.3 菌株XYmy-A1分子生物學鑒定 測序結果顯示，菌株XYmy-A1的16S rDNA序列長度為1451 bp（GenBank登錄號：OM721736）。NCBI序列比對結果顯示，菌株XYmy-A1的16S rDNA序列與已報道的菌株Pectobacterium aroidearumstrain SCRI 109（NR159926.1）的相似性為99.72%。以迪基氏菌屬（Dickeya dieffenbachiae）為外群，構建基于16S rDNA序列的系統發育進化樹，結果（圖4）顯示，菌株XYmy-A1與環狀果膠桿菌（P.aroidearum）聚為一個類群，而與胡蘿卜果膠桿菌（P.carotovorum）、馬蹄蓮果膠桿菌（P.zantedeschiae）、黑腐果膠桿菌（P.atrosepticum）和山葵果膠桿菌（P.wasabiae）的親緣關系較遠。

圖4 基于16S rDNA序列構建的菌株XYmy-A1系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain XYmy-A1 constructed based on 16S rDNA sequence

結合形態、致病性和16S rDNA序列系統發育分析結果，確定引起白魔芋軟腐病的病原菌XYmy-A1為環狀果膠桿菌。

2.3 殺菌劑對菌株XYmy-A1的室內抑菌活性

室內平板抑菌試驗結果（表2）顯示，供試的13種殺菌劑中，只有80%乙蒜素乳油、5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑、25%溴菌腈微乳劑、3%中生菌素可溶液劑、0.3%四霉素水劑、1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑7種殺菌劑對病原菌的生長具有抑制作用，且不同殺菌劑的抑制效果存在差異。80%乙蒜素、5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑、25%溴菌腈微乳劑、3%中生菌素可溶液劑和0.3%四霉素水劑5種殺菌劑在5個梯度濃度下均有明顯的抑制效果，而1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑只有在高濃度時才具有抑菌效果。7種殺菌劑室內毒力測定結果（表3）顯示，0.3%四霉素水劑對菌株XYmy-A1的抑制活性最強，其EC50較低，為0.1980 mg/L，說明病原菌株對該殺菌劑最敏感，5%溴菌腈微乳劑次之，其EC50為9.1359 mg/L，1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑對病原菌的抑制作用最差，其EC50較高，為654.5806 mg/L。

表2 不同殺菌劑對菌株XYmy-A1的抑菌效果Table 2 Inhibitory activity of different bactericides against the pathogen strain XYmy-A1

3 討論

果膠桿菌屬的菌株高度異質化，目前已被報道的有10多種，其宿主范圍廣泛，可引起多種植物的軟腐病（Ma et al.，2007；商雨等，2015；馮潔，2017；Portier et al.，2019）。Nabhan等（2013）基于表型、DNA-DNA雜交、16S rDNA和多位點序列分析等將環狀果膠桿菌從胡蘿卜果膠桿菌中分離出來，確立為一個新種，認為該菌株主要侵染和引發單子葉植物細菌性軟腐病，隨后，該物種首次在我國報道為大白菜軟腐病的病原菌，并發現在人工接種條件下該菌株還可侵染多種單、雙子葉植物（李曉穎等，2018；Xie et al.，2018）。該病原菌的已知寄主范圍不斷擴大，近年來在天南星科如半夏、芋頭、合果芋、花魔芋和珠芽魔芋等多種作物上均有發現由環狀果膠桿菌侵染引起的軟腐病（魏環宇等，2020；Wei et al.，2020；Xu et al.，2020；Wang et al.，2021；趙玳琳等，2022），但目前尚無針對白魔芋軟腐病的相關研究報道。本研究分離、鑒定白魔芋軟腐病病原菌菌株XYmy-A1，其引起的病癥與其他魔芋軟腐病的發病癥狀相似，系統進化樹分析顯示其與環狀果膠桿菌的相似性最高，但與已報道的引起魔芋軟腐病的病菌環狀果膠桿菌不同（孫苗苗，2019；Sun et al.，2019；魏環宇等，2020；Wei et al.，2020；崔雙等，2021），推測可能是病原菌適應不同環境因素及宿主作物不同，使得不同環境因素及宿主作物的優勢病原菌株也存在差異。

殺菌劑對病原菌的室內毒力是衡量藥劑對病原菌毒力大小的一個重要指標，能直接體現藥劑對病原菌的抑制或致死能力（趙洪濤等，2019）。本研究的室內毒力測定結果顯示，80%乙蒜素乳油、5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑、25%溴菌腈微乳劑、3%中生菌素可溶液劑和0.3%四霉素水劑5種殺菌劑在供試濃度下對白魔芋軟腐病病原菌生長具有抑制作用，1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑只有在高濃度下對白魔芋軟腐病病原菌生長具有抑制作用，其余殺菌劑均無抑制效果。有抑制效果的殺菌劑可大致分為三類：化學殺菌劑（25%溴菌腈微乳劑、1.5%噻霉酮水乳劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑），新型植物仿生農藥（80%乙蒜素乳油和5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑）以及農用抗生素類（3%中生菌素可溶液劑和0.3%四霉素水劑）。溴菌腈是一種廣譜性殺菌劑，尤其是對炭疽病的防治效果較好（肖敏等，2017；韓文啟等，2018），蒙姣榮等（2015）發現溴菌腈對桑樹細菌性枯萎病菌有一定的抑制效果；葉火春等（2020）發現丙硫唑與溴菌腈以質量比1∶2混配對杧果細菌性角斑病菌田間防效高達80%。本研究中白魔芋軟腐病病原菌XYmy-A1對25%溴菌腈微乳劑的敏感性很高，1600倍液（有效濃度156.25 mg/L）時的抑制率達71.95%，EC50為9.1359 mg/L。噻霉酮多用于防治真菌病害，近年來也有少量利用噻霉酮防治細菌性病害的研究，范可地等（2018）發現3%噻霉酮可濕性粉劑在田間能有效防治水稻細菌性條斑病，尤其是與20%噻唑鋅懸浮劑或20%噻菌酮懸浮劑復配使用的效果更佳；馮迪南等（2018）發現1.5%噻霉酮水乳劑對馬鈴薯軟腐病病原菌具有平板抑菌效果，但本研究發現1.5%噻霉酮水乳劑在高于推薦使用濃度時才對菌株XYmy-A1有抑制效果。乙蒜素是大蒜素的同系物，其作為一種植物仿生農藥被廣泛應用于防治棉花枯萎病等，近年來也有少量關于其對細菌性病害的防治研究，如張京等（2021）通過室內和田間藥效試驗發現，80%乙蒜素乳油可作為防治大豆細菌性斑點病的首選藥劑。本研究中白魔芋軟腐病病原菌對80%乙蒜素乳油和5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑的敏感性也較高，80%乙蒜素乳油在2000倍液（有效成分濃度為400.00 mg/L）時的抑制率可達60.00%以上，EC50為99.9482 mg/L，因此，乙蒜素是一種對抑制白魔芋軟腐病病原菌有效的殺菌劑，但其與氨基寡糖素復配使用能否協同增效還有待田間進一步驗證。農用抗生素類殺菌劑0.3%四霉素水劑與3%中生菌素可溶液劑相比，0.3%四霉素水劑在1000倍液（有效成分濃度為3.00 mg/L）時對菌株XYmy-A1的抑制率可達65.71%，EC50為0.1980 mg/L，而3%中生菌素可溶液劑在1000倍液（有效成分濃度為30.00 mg/L）時的抑制率為35.44%，EC50為102.5101 mg/L，因此，0.3%四霉素水劑可作為一種首選藥劑與其他藥劑交替使用以防治白魔芋軟腐病。本研究僅限于室內平板篩選的毒力測定結果，有一定的局限性，如銅制劑、內吸性殺菌劑氯溴異氰尿酸等在平板上的抑菌效果雖然未體現出來，但也不能否定其田間的利用效果，且不同的殺菌劑在植物上的作用機理不同，其對病害的防治效果也不同（張盧慧等，2021）。因此，篩選獲得的殺菌劑還需進一步開展田間試驗確定其防治效果及最適濃度，以便為田間病害防控提供依據。

4 結論

引起貴州省安龍縣白魔芋軟腐病的病原菌為環狀果膠桿菌，可首選0.3%四霉素水劑和25%溴菌腈微乳劑進一步開展田間防效試驗，1.5%噻霉酮水乳劑、3%中生菌素可溶液劑、80%乙蒜素乳油和5%氨基寡糖素·20%乙蒜素微乳劑可作為備選藥劑。