小麥赤霉病菌拮抗菌的篩選及拮抗特性研究

李艷情，翟煥趁，薛曉雯，覃雨良，張帥兵，呂揚勇，魏 閃，馬平安，乙江嵐，胡元森

（河南工業大學生物工程學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

【研究意義】禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是小麥赤霉病的主要病原菌，該菌不僅使小麥產量減少，還會產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）等真菌毒素。近年來，受全球氣候及農業秸稈處理方式變化的影響，小麥赤霉病在世界各地頻發，毒素污染日趨頻繁，嚴重影響了農產品的品質和食品安全（Zhang et al.，2014）。盡管種植抗病品種小麥是防治赤霉病的理想措施，但農作物的抗性改良難度大、進展緩慢，目前最常用的防治方法依然是使用化學殺菌劑，其長期使用必然會導致病原菌耐藥性增強、環境污染等問題（Wegulo et al.，2015）。因此，篩選禾谷鐮刀菌拮抗菌，開發生防菌劑是一條不可忽視的重要途徑?！厩叭搜芯窟M展】國內外研究發現，真菌、放線菌和細菌等多種微生物對禾谷鐮刀菌均具有抑制作用。有研究發現，釀酒酵母菌在室內和田野中均可使禾谷鐮刀菌的生長受到抑制，降低赤霉病的發生率（Schisler et al.，2011）；土壤中分離的木霉（Trichoderma gamsii）6085能減少水稻和小麥中赤霉病的發生（Matarese et al.，2012）；Palazzini等（2017）發現放線菌中的鏈霉菌（Streptomycessp.）RC87B能防控小麥赤霉病及減少DON的產生。能拮抗禾谷鐮刀菌的細菌研究報道較多，這些拮抗菌包括從不同材料中分離的不同種屬的菌種，不同拮抗細菌具有各自的特性，以不同的機制抑制禾谷鐮刀菌菌體生長或阻控DON毒素的產生，具有潛在的生防應用價值。一種分離于小麥根際土壤的銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）可通過產生抗菌物質吩嗪-1-甲酰胺（PCN）而抑制禾谷鐮刀菌在小麥穗和籽粒上產生DON毒素（Sun et al.，2021）；從小麥種子內分離的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）可通過形成生物膜、合成嗜鐵素、吲哚乙酸等抗菌物質防控赤霉病的發生（Herrera et al.，2016）；從田間土壤中分離的奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）等對小麥禾谷鐮刀菌的侵染有重要的防控效果（徐劍宏等，2013；冉軍艦等，2016；周清等，2019；馬東方等，2021）。也有研究表明，禾谷鐮刀菌拮抗菌的存在并不限于在與小麥種植相關的土壤或植株中，在其他環境中分離到的一些拮抗菌可表現出某些獨特的化學特性和生物學功能。Zhao等（2015）從絲瓜花粉囊中分離到一株枯草芽孢桿菌，其抗菌活性與菌株產生的幾丁質酶和抗菌肽有關；從普通花生殼、高寒草甸牦牛牛糞中分離的解淀粉芽孢桿菌可通過產生伊枯草素等胞外脂肽類物質抑制禾谷鐮刀菌生長和毒素產生（Shi et al.，2014；陳亮等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】在不同地域、環境及廣泛的基質中繼續開展禾谷鐮刀菌拮抗菌的分離、篩選，深入研究其生物學特性，是探索對日益嚴重的小麥赤霉病發生和DON污染的重要解決方案，是對現有防控手段研發的重要補充?！緮M解決的關鍵問題】采用平板對峙法篩選對禾谷鐮刀菌具有抑制作用的菌株，根據菌落形態、生理生化特性和16S rDNA系統發育分析對拮抗菌進行種類鑒定；通過PCR擴增抗菌脂肽基因、發酵條件試驗、抑菌物質的抑菌特性分析進行拮抗菌的拮抗特性研究；通過接種小麥穗和小麥籽粒試驗驗證拮抗菌對小麥赤霉病的防治效果及對DON毒素的抑制作用，以期從小麥根際土壤中分離對小麥赤霉病菌具有拮抗作用的生防菌株，為防控小麥赤霉病和DON毒素污染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥根際土壤分別采自河南省鄭州市西郊（東經113°27＇53.2″，北緯34°49＇18.0″）、濮陽市南樂縣（東經115°5＇41.8″，北緯36°8＇9.0″）和商丘市柘城縣（東經115°19＇58.8″，北緯34°7＇25.9″）等地，鄭州的土壤為褐土，濮陽和商丘的土壤為潮土，連續多年種植小麥，赤霉病害偶有發生。禾谷鐮刀菌野生型菌株PH-1由福建農林大學病原真菌與真菌毒素重點實驗室惠贈；大腸桿菌菌株DH5α由河南工業大學糧油食品微生物危害防控創新實驗室保存；小麥購買自河南省農業科學院種子中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌的分離鑒定

1.2.1.1 禾谷鐮刀菌菌絲及其孢子培養 將保存在-80 ℃冰箱中的菌株PH-1活化，取菌落邊緣的菌絲塊接種到CM固體培養基（蔗糖10.0 g/L、酸水解干酪素6.0 g/L、酵母粉6.0 g/L、瓊脂粉20.0 g/L）中，28 ℃培養3 d，用于抑菌試驗；菌絲接種到CMC培養基（羧甲基纖維素鈉16.0 g/L、硝酸銨1.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、酵母粉1.0 g/L）中，28 ℃下150 r/min搖床培養3 d，過濾收集孢子，將孢子濃度調節為1×106CFU/mL，用于拮抗菌篩選及對孢子萌發、DON毒素合成的影響等試驗。

1.2.1.2 拮抗菌的分離與篩選 將采集的小麥根際土壤采用梯度稀釋法依次制備10-3、10-4和10-5稀釋度的懸液，將不同稀釋度的懸液100 μL涂布在LB培養基平板上，30 ℃培養2 d，挑取顏色、形態不同的細菌菌落進行純化、保存。進一步對分離獲得的菌株進行抑制試驗：在距離CM培養基平板中心2 cm處接種待測細菌的菌液，28 ℃培養1 d后，將菌株PH-1的菌絲塊接種在培養皿中心，28 ℃培養4 d后觀察是否有抑菌圈出現，有抑菌圈出現的為拮抗菌，測量其抑菌圈直徑（周清等，2019）。

1.2.1.3 拮抗菌鑒定 將拮抗菌在LB培養基上劃線，37 ℃培養1 d，觀察其菌落特征；對拮抗菌進行革蘭染色，觀察其個體細胞形態和顏色；對拮抗菌進行生理生化特性分析（東秀珠和蔡妙英，2001）。為明確拮抗菌株的屬種，以DNA為模板，擴增菌株的16S rDNA 序列并進行測序，測出的序列在NCBI數據庫進行比對，運用MEGA 7.0基于16S rDNA構建菌株的系統發育進化樹；同時擴增脂肽合成基因以鑒定拮抗物質的特性，所需引物序列參考陳亮等（2017）的方法。16S rDNA和抗菌脂肽基因的PCR擴增體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，2×RapidTaqMaster Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：（1）擴增16S rDNA序列的程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃1 min，進行35個循環；72 ℃延伸5 min。（2）擴增抗菌脂肽相關基因的程序：表面活性素基因（sfp）、豐原素基因（fenB）和伊枯草菌素基因（ituD）擴增的退火溫度分別為47、57和46 ℃，其他擴增條件與16S rDNA序列擴增的程序相同。

1.2.2 拮抗菌的拮抗特性測定

1.2.2.1 不同培養基對拮抗菌生長的影響 將過夜培養的拮抗菌發酵液按5%的接種量分別接種到含有100 mL CM、LB和PDA液體培養基的三角瓶中，37 ℃下180 r/min搖床培養，0～24 h內每2 h取樣，此后每12 h取樣，測定拮抗菌的OD600，觀察不同培養基中拮抗菌的生長情況，找出最優發酵條件。

1.2.2.2 拮抗菌中抑菌物質的定位 將過夜培養的拮抗菌發酵液接種于100 mL CM液體培養基中，37 ℃發酵10 h，收集發酵液進行離心，上清液用0.22 μm濾膜抽濾后獲得無菌上清液；離心后的沉淀通過無菌PBS洗滌2次，超聲破碎30 min，12000 r/min離心25 min，取上清即為菌體破碎液。將菌株PH-1菌落最邊緣的菌絲塊接種在CM培養基中心，在距離平板中心2 cm處用打孔器打孔并棄去孔內培養基，在孔內分別加入150 μL不同濃度的無菌上清液或菌體破碎液，以無菌水為對照，28 ℃培養箱中靜置3 d，觀察拮抗效果（何露，2019）。

1.2.2.3 拮抗菌無菌上清液對禾谷鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發的影響 向融化并晾至55 ℃左右的100 mL CM固體培養基中分別加入4、8和16 mL無菌上清液，不加無菌上清液的CM培養基作對照，充分混勻后倒平板。在培養皿中央接種菌株PH-1的菌絲，28 ℃培養3 d，觀察菌落形態和生長變化。分別將0.8、1.6和8.0 mL拮抗菌的無菌上清液加入到CM液體培養基（蔗糖10.0 g/L、酸水解干酪素6.0 g/L、酵母粉6.0 g/L）至總體積為16 mL，以不加無菌上清液的CM液體培養基為對照，于25 ℃下180 r/min 搖床培養，24 h時觀察并記錄菌株PH-1孢子的萌發情況。

1.2.2.4 拮抗菌無菌上清液及其粗提蛋白的穩定性分析 無菌上清液的穩定性用溫度、酸、堿處理進行分析，參考朱明杰（2013）的方法，略有改動。將無菌上清液分別在40、50、60、70、80、90和100 ℃條件下處理30 min，以25 ℃下的無菌上清液為對照；取無菌上清液分別調節pH為3、4、5、6、7、8、9、10和11，處理24 h后再調節pH至中性條件；測定各種處理后的無菌上清液對菌株PH-1菌絲生長的抑制率。無菌上清液中的蛋白粗提液通過硫酸銨沉淀法制備，操作流程參考何露（2019）的方法，將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K分別加入蛋白粗提液中，使其終濃度為1 mg/mL，37 ℃處理2 h，然后通過平板對峙抑菌試驗分析粗提蛋白對3種酶的敏感特性。

1.2.2.5 拮抗菌無菌上清液對禾谷鐮刀菌DON毒素的影響 滅菌后的50 g小麥中分別加入不同濃度無菌上清液，加無菌水為對照，然后接種菌株PH-1孢子液，28 ℃靜置培養，21 d時測定小麥中的DON毒素，每組均設3個重復，分析無菌上清液對DON毒素的影響，具體操作參考孟瑤等（2019）的方法。

1.2.3 拮抗菌對小麥赤霉病的防治效果及對小麥生長的影響

1.2.3.1 拮抗菌無菌上清液對小麥赤霉病的防治效果 用菌株PH-1孢子液（濃度為1×105CFU/mL）和拮抗菌發酵后的無菌上清液制備接種液，調節無菌上清液的濃度分別為25%、50%和100%，以無菌水為對照，向揚花初期的小麥穗中接種，具體操作和結果分析參考武愛波（2005）的方法，分析拮抗菌的無菌上清液對小麥赤霉病的防控效果。

1.2.3.2 拮抗菌無菌上清液對小麥生長的影響用2%次氯酸鈉對小麥進行表面消毒，再使用無菌水洗滌3次后轉移至玻璃杯中，濕紗布進行保溫培養至小麥種子露白，選擇長勢一致的種子用拮抗菌發酵液的無菌上清液處理24 h，無菌水、無菌CM培養基處理為對照，將處理過的小麥種子栽種于花盆中，22 ℃溫室中培養21 d，觀察小麥生長情況，測定小麥莖長、根長和濕重。

1.3 統計分析

試驗數據運用SPSS 20進行單因素方差分析和配對樣本T檢驗，使用Prism 8制圖。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的分離與篩選結果

經稀釋分離和平板培養分離從采集的多個小麥根際土壤樣本中分離得到800多株細菌，經對峙法抗菌檢測獲得5株禾谷鐮刀菌的拮抗菌；通過進一步的抗菌比較，發現5株菌株對禾谷鐮刀菌的抑制效果存在差異（表1），其中以菌株XW-10的抑菌圈直徑最大，拮抗效果最好（圖1）。后續試驗選擇菌株XW-10進行拮抗特性研究。

圖1 菌株XW-10對禾谷鐮刀菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effect of strain XW-10 on F.graminearum

表1 拮抗菌對禾谷鐮刀菌的拮抗活力Table 1 Antagonistic activity of antagonistic bacterial strains against F.graminearum

2.2 拮抗菌XW-10鑒定結果

拮抗菌XW-10在LB培養基上菌落呈白色，不透明，表面較干糙，為革蘭氏陽性菌，桿狀，能產生芽孢（圖2）。對拮抗菌進行細菌學生理生化特性分析顯示，接觸酶、甘露醇、木糖、檸檬酸鹽、淀粉水解、VP試驗、葡萄糖、L-阿拉伯糖、酪蛋白水解和明膠液化等試驗均為陽性，50 ℃生長、pH 5.7生長、7%氯化鈉生長等為陽性，甲基紅試驗陰性，生理生化特性與解淀粉芽孢桿菌相符。進一步對拮抗菌進行分子生物學分析，16S rDNA克隆測序表明，其片段長度為1449 bp（GenBank序列號：ON326557.1），經NCBI比對獲得與其同源性較高的菌株，利用NJ法構建系統發育進化樹，結果（圖3）顯示，拮抗菌XW-10的16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）位于同一分支，相似性達100%，其他各分支的相似性均較低?；谵卓咕男螒B特征、生化特性和16S rDNA系統發育分析結果，確定拮抗菌XW-10為解淀粉芽孢桿菌。在該菌中擴增抗菌脂肽合成相關的關鍵基因，結果（圖4）顯示，可在菌株中擴增出1400 bp的fenB基因、1100 bp的sfp基因和1203 bp的ituD基因片段，表明拮抗菌XW-10具有合成抗菌脂肽的能力。

圖2 菌株XW-10的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of strain XW-10

圖3 基于16S rDNA序列構建的菌株XW-10系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain XW-10 based on 16S rDNA sequences

圖4 抗菌脂肽合成相關基因的PCR擴增Fig.4 PCR amplification of genes related to antagonistic lipopeptide synthesis

2.3 拮抗菌XW-10在不同培養基中的生長情況

分析拮抗菌在CM、LB和PDA等不同培養基中的生長情況，結果（圖5）顯示，拮抗菌在CM培養基中培養10 h時，菌液的OD600達最大，為1.91，細胞數目達最多，此后至48 h無明顯變化；在LB培養基中培養24 h時雖然也能達到與CM培養基中同樣的OD600，但時間較長；在PDA培養基中培養8 h時OD600達最高，但仍低于其他培養基，因此，在CM培養基中培養10～48 h為拮抗菌發酵的最佳時期。

圖5 拮抗菌XW-10在不同培養基中的生長情況Fig.5 Growth of antagonistic bacterium XW-10 in different media

2.4 拮抗菌XW-10發酵液對禾谷鐮刀菌菌絲生長的影響

分析拮抗菌XW-10的不同濃度發酵液對菌株PH-1生長的抑制情況，結果（圖6）顯示，菌株XW-10的發酵液濃度越高，菌株PH-1菌絲生長越慢，加入16%菌株XW-10發酵液時抑制率達45.00%。

圖6 拮抗菌XW-10發酵液對禾谷鐮刀菌PH-1菌絲生長的影響Fig.6 Effects of antagonistic bacterium XW-10 fermentation broth on mycelium growth of F.graminearum PH-1

2.5 拮抗菌XW-10拮抗物質的定位與拮抗作用測定結果

為進一步明確拮抗菌的拮抗物質在細胞內外存在的情況，將拮抗菌XW-10發酵后的無菌上清液和菌體破碎液進行抑菌分析，結果（圖7）顯示，拮抗菌的無菌上清液可顯著抑制禾谷鐮刀菌PH-1菌絲的生長，而菌體破碎液對禾谷鐮刀菌菌絲生長無明顯的抑制作用，表明拮抗菌的拮抗物質主要分泌在細胞外，即在發酵上清液中。顯微鏡下觀察拮抗菌對禾谷鐮刀菌菌絲形態的影響，結果（圖8）顯示，培養基中不加拮抗菌的無菌上清液時，禾谷鐮刀菌的菌絲呈現長而直的形態，生長方向有序，分支均勻；但培養基中加有拮抗菌的無菌上清液時，禾谷鐮刀菌的菌絲生長出現畸形，菌絲分支增多，菌絲中間出現“蓮藕狀”的節點，顯示拮抗菌的無菌上清液對禾谷鐮刀菌菌絲生長和菌絲形態均有顯著影響。分析不同濃度的拮抗菌無菌上清液對禾谷鐮刀菌孢子萌發的影響，結果（圖9、圖10）顯示，在培養24 h時，未用拮抗菌的無菌上清液處理禾谷鐮刀菌的孢子全部萌發；用不同濃度的拮抗菌無菌上清液處理禾谷鐮刀菌的孢子時，孢子萌發受到影響，隨無菌上清液濃度的增加，孢子萌發率下降，在無菌上清液濃度為100%時，禾谷鐮刀菌的孢子萌發被完全抑制。

圖8 拮抗菌XW-10的無菌上清液對禾谷鐮刀菌菌絲形態的影響Fig.8 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on F.graminearum mycelial morphology

圖9 拮抗菌XW-10無菌上清液對禾谷鐮刀菌孢子萌發的抑制作用Fig.9 Inhibition effect of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on F.graminearum spore germination

圖10 拮抗菌XW-10的無菌上清液對禾谷鐮刀菌孢子萌發的影響Fig.10 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on F.graminearum spore germination

2.6 拮抗菌XW-10無菌上清液的穩定性測定結果

為明確拮抗菌XW-10發酵無菌上清液的穩定性，進一步分析不同溫度和pH處理對拮抗菌的無菌上清液拮抗活性的影響，結果（圖11）顯示，在低于90 ℃處理時，拮抗菌的無菌上清液對菌株PH-1菌絲生長的抑制效果未受溫度的影響，經100 ℃處理后則完全喪失抑菌活性。將拮抗菌的無菌上清液經過酸或堿處理后進行抑菌試驗，結果（圖12）顯示，在pH為7時，拮抗菌的無菌上清液對菌株PH-1菌絲生長的抑制率最高，達48.38%，pH＜4或pH＞8時抑菌活性明顯下降。穩定性測定結果表明，拮抗菌的無菌上清液在100 ℃時失活，拮抗物質適合在pH為中性條件下發揮抑菌作用。

圖11 拮抗菌XW-10無菌上清液對溫度的敏感性Fig.11 Sensitivity of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant to temperature

圖12 拮抗菌XW-10無菌上清液對pH的敏感性Fig.12 Sensitivity of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant to pH

2.7 拮抗菌XW-10無菌上清液的粗提蛋白對蛋白酶的敏感特性

通過硫酸銨沉淀法提取拮抗菌XW-10無菌上清液中的粗蛋白并經過不同酶處理，分析粗蛋白對禾谷鐮刀菌的拮抗作用。與對照相比，拮抗菌XW-10蛋白粗提液對禾谷鐮刀菌的菌絲生長有明顯的抑制作用；粗提蛋白經木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K處理后對禾谷鐮刀菌生長的抑制效果與未處理的粗蛋白基本一致，說明拮抗菌XW-10無菌上清液中的粗蛋白對胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K均不敏感（圖13）。

圖13 拮抗菌XW-10粗提蛋白對3種酶的敏感性Fig.13 Sensitivity of crude antagonistic bacterium XW-10 protein to three enzymes

2.8 拮抗菌XW-10無菌上清液對禾谷鐮刀菌DON毒素積累的影響

為解析拮抗菌對禾谷鐮刀菌DON毒素積累的影響，將禾谷鐮刀菌的孢子液和不同濃度的拮抗菌XW-10無菌上清液同時加入到小麥基質培養基中，21 d時測定小麥基質中DON毒素含量，結果（圖14）顯示，不加拮抗菌無菌上清液的小麥中DON毒素含量達2316.5 μg/kg，而添加拮抗菌無菌上清液比例分別為30%和50%時，小麥中DON毒素濃度分別為540.9和96.0 μg/kg，比對照組分別下降92%和94%；全部為拮抗菌無菌上清液時，產生的毒素僅為50.2 μg/kg，表明拮抗菌XW-10無菌上清液顯著降低了DON毒素在小麥基質中的含量。

圖14 拮抗菌XW-10無菌上清液對小麥基質中DON毒素合成的影響Fig.14 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on DON toxin synthesis in wheat matrix

2.9 拮抗菌XW-10無菌上清液對小麥的促生長特性和對小麥赤霉病的防控效果

進一步通過盆栽試驗分析菌株XW-10對小麥生長的影響。與對照組相比，用拮抗菌XW-10無菌上清液處理的小麥生長態勢較好，小麥的莖長、根長、濕重均顯著增加（P＜0.05）（圖15和表2），表明拮抗菌XW-10具有促進小麥苗生長的作用。將菌株PH-1孢子液接種到揚花期的小麥穗上，測驗拮抗菌對小麥赤霉病的防病效果，結果（圖16）顯示，對照組小麥籽粒染病粒率超過95%，將麥穗分別用25%、50%和100%濃度的菌株XW-10發酵無菌上清液噴霧處理后再接種病菌，可觀察到發病籽粒數目明顯減少，噴霧100%發酵上清液的相對防效達51%，說明菌株XW-10發酵上清液對小麥赤霉病具有明顯的防治效果。

圖16 拮抗菌XW-10無菌上清液對小麥赤霉病的防控效果Fig.16 Prevention and control effect of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on wheat scrab

表2 拮抗菌XW-10無菌上清液對小麥幼苗基本生長的影響Table 2 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on basic growth of wheat seedlings

圖15 拮抗菌XW-10無菌上清液對小麥生長的影響Fig.15 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on wheat growth

3 討論

生物防治具有次生危害小、環境友好等優勢，可減少化學農藥殘留、病原菌產生耐藥性等當前農業生產中存在的突出問題（Zhou et al.，2021），已成為農作物病蟲害防控發展的方向。國內外有許多學者投入了農業病害拮抗微生物的研究，在菌株篩選、拮抗物質分離及作用機理解析等方面有許多新發現，并在不斷豐富農業病害生物防治的知識庫。本研究分離的菌株XW-10經16S rDNA和細菌學生理生化分析鑒定，確定為解淀粉芽孢桿菌，這是一類作物栽培土壤中常見的細菌。盡管該菌與已報道的拮抗菌在生物分類上隸屬于同一種群，但從不同環境分離的菌株可能具有不同的抑菌活性。王軍華等（2006）報道的解淀粉芽孢桿菌Q-12也分離自土壤，研究發現其產生的抗菌物質可抑制鐮刀菌、曲霉、青霉等多種能引起食品腐敗的病原菌生長，有很好的作為食品防腐劑的潛力；Fan等（2018）研究發現，解淀粉芽孢桿菌FZB42除次生代謝產物外，揮發性有機化合物在生物和非生物脅迫下均對作物病害有防控效果，并且具有廣譜抗性，對小麥、草莓、生菜和馬鈴薯等多種植物病害均具有明顯的防治效果。因此，在已有研究的基礎上開展新分離的解淀粉芽孢桿菌的生物學特性分析及作物病害防控研究可進一步挖掘其實際應用價值。

本研究分離的拮抗菌XW-10經PCR擴增發現含有fenB、sfp和ituD等與抗菌脂肽合成相關的關鍵基因，因而具有合成抗菌脂肽的潛在能力。研究發現，菌株XW-10在胞外產生抑菌物質，因而有效成分主要在發酵上清液中，這一結果與張寶（2014）、葉景文（2017）等多數研究解淀粉芽孢桿菌拮抗作用的報道相同。本研究利用拮抗菌XW-10無菌上清液對禾谷鐮刀菌進行菌絲生長和孢子萌發的影響試驗，發現拮抗菌無菌上清液可使鐮刀菌的菌絲形態發生明顯畸變，孢子萌發率下降，與胡元森等（2013）報道的拮抗菌株Jc-07發酵濾液對禾谷鐮刀菌的抑制作用相同。本研究也發現拮抗菌的無菌上清液中具有抑菌作用的可能是某種蛋白，對該抑菌物質的分離純化及抑制機理研究有待進一步開展。

作物病害防控最終的目標是在田間開展應用，這對生防菌劑提出了較高要求，不僅需要保證菌劑對種植作物生長不產生有害影響（Huang et al.，2016；周清等，2019），還要求菌劑具有良好的穩定性和對不良環境的較強抗性（周鵬，2014；Palazzini et al.，2016；Awla et al.，2017）。通過小麥苗種植試驗表明，菌株XW-10及其代謝產物對小麥苗的生長表現出一定的促進作用，呈現了該菌的良好應用潛質。拮抗菌對植物的促生長作用與很多因素有關，如產鐵載體、產吲哚乙酸、解磷作用、固氮作用、拮抗作用等。周清等（2019）從小麥根際土壤分離出一株奇異變形桿菌DY05，馬莉敏（2021）從芳香植物百里香根部分離出內生菌銅綠假單胞菌XBLGC3，這2種不同的菌株不但對禾谷鐮刀菌有顯著的拮抗作用，而且均能產生鐵載體和吲哚乙酸，對小麥的生長有顯著的促進作用。本研究分離獲得的拮抗菌XW-10對小麥促生長的機制有待深入研究，但拮抗菌在控制病原菌的同時可促進植物生長的特性為拮抗菌在農業生產中的應用打下基礎。

在有效成分的穩定性方面，解淀粉芽孢桿菌具有芽孢桿菌本身固有的抗熱特性，菌株XW-10無菌上清液對90 ℃以下的高溫均有良好的穩定性，這些特性對于實際應用具有重要意義。我國小麥產區赤霉病主要發生在5月份前后的小麥揚花期或乳熟期，該時期氣溫已逐漸升高，在強烈的陽光輻射下田間的溫度更高，如果將發酵液直接在田間噴灑進行生防處理，則有效成分的耐熱性成為直接影響作用效果的關鍵因素。如果需要將生防物質商品化，為了便于儲藏、運輸，通?？赏ㄟ^濃縮、添加載體等處理制成粉劑，在這些后處理環節，發酵液的加工工藝過程均對菌體及其有效成分的抗熱性和穩定性提出較高要求。

4 結論

本研究從小麥根際土壤中分離獲得的菌株XW-10經鑒定為解淀粉芽孢桿菌，在發酵無菌上清液中具有可抑制禾谷鐮刀菌生長和DON毒素產生的拮抗物質；拮抗菌XW-10發酵無菌上清液對小麥苗生長有益，可明顯減少麥穗中的赤霉病粒比例；產生的拮抗有效物質屬于蛋白類化合物，其活性不被常規蛋白酶鈍化，穩定性和耐熱性良好，具有作為小麥赤霉病生防菌劑的潛質。