低溫脅迫對葛藤幼苗生長發育及生理特性的影響

趙文武，黃莉娟，趙麗麗，王雷挺，謝文輝

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】低溫是植物生長周期中最常見的非生物脅迫之一。當環境溫度長時間低于植物生長所需的適宜溫度時，就會對植物形成低溫脅迫，根據嚴重程度可分為冷害（一般為0～10 ℃）和凍害（一般在0 ℃以下）（宋靜爽等，2019），植株遭受嚴重凍害時甚至會發生死亡。冷害多發生在我國高緯度的東北和高海拔的云貴高原等地區（蔡志歡和張桂蓮，2018）。葛藤（Pueraria lobata）為豆科（Leguminosae）多年生藤本植物，在我國分布廣泛，尤其在我國南方各地數量較多，其根、莖、藤均可入藥，作為牧草和飼料加工原材料時可用于防治動物的某些疾病，具有良好的飼藥合用特質。葛藤具有耐貧瘠、耐干旱、抗病蟲害能力強等特點，還具有喜鈣性及巖生性特征，能在土壤和水分嚴重虧缺的石漠化地區生長，可作為石漠化治理的先鋒植物（陳俊等，2014）。作為高蛋白的飼草資源，葛藤藤莖生長旺盛，可常年提供青綠飼料（鄭霞等，2018），能有效緩解我國南方高蛋白牧草季節性不均衡的問題。葛藤喜歡溫暖的氣候，適宜生長溫度為22～26 ℃（陳俊等，2014），在冷害發生區，低溫成為限制葛藤生長的首要因素。因此，研究葛藤在低溫下的生長狀況，對葛藤種質的耐低溫鑒定及在西南地區的推廣應用具有重要意義。【前人研究進展】生理生化指標可作為評價植物抗寒性的重要指標。正常環境下，細胞內活性氧（ROS）的產生和清除處于動態平衡（Mittler et al.，2011），低溫會引起ROS大量積累，進而誘導膜脂過氧化并產生丙二醛（MDA）（Velikova et al.，2000）。植物會形成一系列復雜的酶和非酶防御系統來維持這一動態平衡（Uemura et al.，2003）。田豐等（2018）對低溫處理后的小麥幼苗進行研究，發現超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性及脯氨酸（Pro）等滲透調節物質含量均隨溫度的降低而升高，以抵抗低溫帶給小麥的不良影響。李倩等（2021）指出當植物遇到低溫冷害時可能會造成生理代謝活動失調，表皮細胞死亡。蓋志佳等（2021）指出低溫會導致種子萌發降低、產量與質量嚴重下降，抗病性減弱等不利影響。低溫還會誘導植物體內激素活性和含量發生改變，進而對植物的生長代謝過程產生影響。逆境脅迫能誘導植物內源脫落酸（ABA）積累，提高植物的抗逆性（劉海卿等，2016），赤霉素（GA）可提高植物體內生長素的含量，調節自由水和束縛水比例，從而對植物的抗寒能力產生影響（Qu et al.，2016）。馬學才等（2021）研究發現油菜可通過增加ABA合成，同時適當減少生長素（IAA）和GA合成來抵御低溫。【本研究切入點】葛藤在我國西南地區可作為優質的牧草飼料來源和環境保護植物物種。目前，與葛藤相關的研究主要集中在其水土保持（丁艷芳，2003）、飼用價值（張倩，2011）、藥用價值（尹樂斌等，2016；房偉，2017）、種子萌發（譚景晨等，2021）等方面，而針對葛藤對低溫脅迫響應的研究鮮見報道。葛藤喜溫，低溫對其生長不利，對葛藤的耐低溫性研究還有待加強。【擬解決的關鍵問題】以葛藤種質為試驗材料，采用盆栽土培試驗，設輕度和重度低溫脅迫處理，對比分析不同低溫處理下葛藤幼苗的生長速度、葉形態、內源激素和生理生化指標變化情況，探明葛藤幼苗耐冷性的生理生化機制，揭示葛藤響應低溫的關鍵機制，為葛藤種質耐低溫鑒定及及合理選育抗冷害性強的種質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葛藤種子由江蘇園林綠化種子公司提供。采取盆栽試驗，花盆長50 cm、寬20 cm、高15 cm，栽培基質為自然土∶蛭石∶腐殖質=1∶1∶1。

1.2 試驗方法

挑選籽粒飽滿、種胚完整、無霉變、大小基本一致的葛藤種子，先用次氯酸鈉溶液浸泡20 min，再用蒸餾水沖洗4～5次后于常溫下萌發，出苗后，每盆選取生長良好且長勢基本一致的葛藤幼苗12株，移入盆栽，置于光照培養箱（晝/夜=25 ℃/20 ℃，光周期12 h/12 h，光照強度30000 LX，相對濕度75%）進行預培養一周。溫度設2個水平梯度，分別為輕度低溫脅迫（記為LD，晝/夜15 ℃/10 ℃）和重度低溫脅迫（記為SD，晝/夜10 ℃/5 ℃）；以晝/夜25 ℃/20 ℃為對照（CK）（條件同預培養）。每處理3個重復。在脅迫第10 d采用隨機法每盆挑選3株葛藤，分別測量各項生長指標，并取新鮮的葛藤葉片用錫箔紙包住迅速置于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱中用于測量各項生理指標。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長指標測定 生長速度：每盆掛牌3株分別在脅迫前和脅迫最后1 d測量對應株高，計算生長速度，生長速度（cm/d）=（脅迫后高度-脅迫前高度）/生長天數。

葉形態：用Epson Perfection V800 Photo（印度尼西亞）掃描儀掃描第3片完全展開功能葉的葉形態，每盆3株。

干鮮比：每盆取3株完整的葛藤植株，洗凈后吸水紙吸干稱重，然后烘干至恒重再次稱重，計算干鮮比。

1.3.2 生理生化指標測定 稱重法測定水含量（來強等，2008）；浸泡法測定相對電導率（高俊鳳，2006）；可溶性糖、Pro和MAD含量及SOD、POD、CAT和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用北京索萊寶科技有限公司試劑盒測定，測定方法均按照說明書進行操作。

采用北京索萊寶科技有限公司試劑盒通過酶聯免疫吸附測定法（ELISA）進行植物組織內ABA、GA3、玉米素（ZT）、IAA等激素含量測定（Zhao et al.，2006）。

1.4 耐低溫能力綜合評價

采用主成分分析法，將各處理葛藤葉片的18個生長及生理生化指標進行降維，并篩選出抗冷性綜合指標，最后采用隸屬函數法綜合評價葛藤的抗冷能力。

綜合指標隸屬函數值（U）：

式中，Xj表示第j個綜合指標；Xmin表示第j個綜合指標的最小值；Xmax表示第j個綜合指標的最大值。

綜合指標權重（W）：

式中，Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度，即權重；Pj為第j個綜合指標的貢獻率。

抗冷能力綜合評價：

式中，D值為各低溫脅迫下由綜合指標評價所得的葛藤抗冷能力值。

1.5 統計分析

利用Excel 2019 進行數據處理，采用Origin 2019作圖，以SPSS 22.0進行差異顯著性、相關及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對葛藤幼苗生長的影響

2.1.1 生長速度、干鮮比、水含量 由圖1可知，與CK相比，LD和SD處理下葛藤幼苗的生長速度（圖1-A）分別顯著下降72.19%和80.15%（P＜0.05，下同）；幼苗干鮮比（圖1-B）分別上升7.59%和30.90%，SD處理上升顯著；葛藤葉片水含量（圖1-C）則隨著低溫脅迫程度的加強而降低，SD處理下較CK顯著降低3.74%。

圖1 低溫脅迫對葛藤幼苗生長速度、干鮮比、水含量的影響Fig.1 Effects of low temperature stress on the growth rate，dryto-fresh ratio and water content of P.lobata seedlings

2.1.2 葉形態 由表1可知，與CK相比，葛藤幼苗在低溫脅迫處理下的葉面積和葉周長均出現下降，LD處理下差異不顯著（P＞0.05，下同），SD處理下差異顯著；低溫下葉寬均顯著低于CK，而葉長差異不顯著。表明低溫會影響葛藤的葉片形態，表現為葉片生長受抑制，葉面積、葉寬、葉周長均明顯小于自然生長的葉片。

表1 低溫脅迫對葛藤幼苗葉形態的影響Table 1 Effects of low temperature stress on the leaf morphology of P.lobata seedlings

2.2 低溫脅迫對葛藤幼苗生理生化指標的影響

2.2.1 Pro和可溶性糖含量及相對電導率 隨著低溫脅迫程度的加強，葛藤幼苗葉片中Pro含量呈上升趨勢（圖2-A），LD 和SD 處理下分別較CK 上升14.02%和37.21%，但差異不顯著。葛藤幼苗葉片可溶性糖含量（圖2-B）和相對電導率（圖2-C）均隨低溫脅迫程度的加強呈上升趨勢，SD處理下分別較CK提高144.65%和279.21%，差異達顯著水平。

圖2 低溫脅迫對葛藤葉片Pro和可溶性糖含量及相對電導率的影響Fig.2 Effects of low temperature stress on the content of Pro，soluble sugar and relative conductivity of P. lobata leaves

2.2.3 MDA含量及保護酶活性 由圖3-A可知，與CK相比，LD和SD處理下，葛藤幼苗葉片的MDA含量有所上升，但差異不顯著。低溫脅迫下各保護酶活性變化趨勢不同，相對于CK，葛藤葉片中SOD（圖3-B）、POD（圖3-C）和APX（圖3-E）活性均呈上升趨勢，SD處理下分別顯著提高41.32%、178.22%和74.67%；LD和SD處理下葉片CAT（圖3-D）活性較CK有所下降，分別降低14.29%和24.33%，但差異不顯著。

圖3 低溫脅迫對葛藤葉片MDA含量和保護酶活性的影響Fig.3 Effects of low temperature stress on MDA content and protective enzyme activity in P.lobata leaves

2.3 低溫脅迫對葛藤幼苗內源激素的影響

隨著低溫脅迫程度的加強，葛藤幼苗葉片ABA含量（圖4-A）、GA3含量（圖4-C）、ZT含量（圖4-D）呈先上升后下降的變化趨勢，均在LD處理時達最大值，ABA含量顯著增加17.46%，GA3和ZT含量分別增加3.31%和4.09%，但差異不顯著；在SD處理下，ABA含量較CK顯著降低25.40%，GA3和ZT含量分別降低5.67%和4.82%，差異不顯著。葛藤幼苗葉片的IAA含量（圖4-B）為CK最高，LD和SD處理下，IAA含量分別下降7.04%和21.38%，但與CK無顯著差異。

圖4 低溫脅迫對葛藤葉片內源激素含量的影響Fig.4 Effects of low temperature stress on the content of endogenous hormones in P.lobata leaves

2.4 低溫脅迫下葛藤幼苗生長發育及生理生化指標的相關分析

對葛藤幼苗的形態指標和生理指標進行相關分析，結果（圖5）表明，各性狀間存在不同程度的相關性。其中生長速度與MDA含量呈顯著負相關；干鮮比與相對電導率和可溶性糖含量呈顯著正相關，與葉面積、葉長、葉寬及葉周長等指標呈顯著負相關；ABA含量與可溶性糖含量和相對電導率分別呈顯著和極顯著（P＜0.01，下同）負相關；Pro含量與APX活性呈極顯著正相關；POD活性與IAA含量呈顯著正相關。

圖5 低溫脅迫下葛藤幼苗19個性狀的相關分析Fig.5 Correlation analysis of 19 traits of P.lobata seedlings under low temperature stress

2.5 低溫脅迫下葛藤幼苗生長發育及生理生化指標的主成分分析

綜合低溫下葛藤幼苗生長發育及生理生化2組指標，根據主成分分析（表2）中特征值大于1的標準選取6個主成分，第一～六個主成分貢獻率分別為45.076%、15.050%、10.463%、8.066%、7.494%、6.714%，累積貢獻率達92.863%，具有較好的代表性，其余可忽略不計。

表2 低溫脅迫下葛藤幼苗18個性狀的主成分分析Table 2 Principal component analysis of 18 traits of P.lobata seedlings under low temperature stress

第一主成分中貢獻率較大的是干鮮比、葉面積、葉寬，低溫脅迫下葛藤生長發育減緩，葉片生長受到一定影響；第二主成分中貢獻率較大的是GA3和MDA含量，低溫下植物膜脂過氧化會造成植物體內MDA積累；第三主成分中SOD活性、Pro和ZT含量貢獻率較大，細胞內抗氧化酶活性及膜保護物質含量越高，幼苗受到的傷害程度就越小；第四主成分中貢獻率較大的是APX活性和IAA含量，其中IAA是生長促進類激素，植物通過降低體內IAA含量，抑制植物生長，增強植物的抗冷性；第五主成分中SOD和CAT活性貢獻率較大，寒冷條件下細胞內保護酶活性的變化反映了葛藤幼苗的抗寒能力；第六主成分中貢獻率較大的是葉長和相對電導率。

2.6 低溫脅迫下葛藤幼苗形態及生理生化指標的綜合性評價

對葛藤的性狀經標準化處理后，將不同溫度下葛藤各主成分得分分別與所對應的貢獻率相乘，最終求出綜合得分，以此來對抗冷性進行綜合評價。前6個主成分可有效表現不同溫度下葛藤的生長情況，其綜合得分情況如表3所示。葛藤抗冷能力的綜合評價值D值隨著脅迫強度的上升而減少，重度低溫脅迫（SD）下葛藤幼苗葉片的D值與輕度低溫脅迫（LD）下D值的平均值相差不大，LD2處理下D值最小，隸屬函數分析表明低溫會對葛藤的生長帶來一定的負面影響。

表3 葛藤幼苗各綜合指標的隸屬函數值、D值及綜合評價Table 3 Membership function value，D value and comprehensive evaluation of each comprehensive index of P.lobata seedlings

3 討論

3.1 低溫脅迫對葛藤幼苗生長的影響

溫度是影響植物生長發育的重要環境因子之一，在低溫下植物的生長會受到嚴重抑制。本研究中，隨著溫度的降低，葛藤幼苗生長速度不斷下降，且這種受抑制的情況在葉片上也存在，葉面積、葉寬、葉周長及水含量與CK相比均出現顯著下降，且溫度越低，各生長指標的值越低，與歐陽孔勝等（2011）對低溫處理甜瓜砧木的研究結果相同。植物細胞中含有大量水分，充足的水分使得植物在生長中枝葉挺立，便于充分接受光照和交換氣體；同時，水分還是植物對物質吸收及轉運的溶劑。水分的減少會限制各種物質在植物體內的運輸，從而導致植株的光合和代謝作用大大減弱，葉片內合成光合產物的原料減少則會使植株營養物質的合成減少，使得植物生長發育減緩。本研究中，葛藤葉片干鮮比隨溫度下降呈上升趨勢，通過觀察葉片，發現有萎焉、收縮現象。表明低溫會引起葛藤葉片水分含量下降，其水分的利用受到一定限制，葉片細胞膨壓不足，不能保持葉片固有姿態，從而發生改變，植株的生長發育也因低溫受到一定程度的抑制。

3.2 低溫脅迫對葛藤幼苗生理生化的影響

低溫環境下植物細胞的滲透勢可通過可溶性物質的積累來調節，從而緩解逆境對膜系統的傷害（侯禎丹等，2019）。可溶性糖和游離脯氨酸是細胞質重要的滲透調節物質。植物體內的可溶性糖積累可提高細胞液濃度，從而降低水勢及冰點（王卓敏等，2016）。本研究中，葛藤幼苗葉片中Pro和可溶性糖含量均隨溫度降低呈上升趨勢，與CK相比在SD處理下葉片中的可溶性糖含量顯著上升279.21%。與前人對番茄（王孝宣等，1998）、西番蓮（董萬鵬等，2015）及棉花（王曉曼等，2020）的研究結果相同，表明葛藤會通過增加體內可溶性糖和Pro的積累，增強自身的保水能力，維持自身滲透勢和膜的正常功能，避免細胞遇冷凝固，防止細胞損傷，從而抵抗低溫脅迫。

基于電解質外滲量測定開發的電導法是在植物上應用較廣泛的抗寒性鑒定方法（王曉輝等，2012），在擬南芥低溫抗性鑒定中普遍采用存活率和相對電導率作為衡量指標，低溫下存活率高、相對電導率低則表明低溫抗性能力強。本研究中，葛藤葉片相對電導率呈上升趨勢，但LD處理下與CK差異不明顯，SD處理時顯著上升。在不同的處理溫度下，抗寒性強的品種相對電導率較低，抗寒性弱的品種相對電導率較高（王召元等，2022）。本研究中葛藤在LD處理下電導率與對照組差異不顯著的結果與前人對谷子（張彬等，2020）、衛矛屬植物（楊航宇和劉長仲，2020）的研究結果相同，表明葛藤在LD處理下具有較好的抗寒性，但具體適宜溫度還有待于進一步驗證。

植物遭受低溫時，細胞內的自由基產生、清除都會受到影響，嚴重時過氧化自由基代謝平衡會被破壞，自由基過多的積累則會導致膜系統受到損傷，造成膜脂過氧化（洪舟等，2020）。膜脂過氧化會使細胞膜滲透性變大，細胞內的MDA大量積累，進而影響植物體內多種正常反應。本研究中，LD處理下葛藤葉片的MDA含量有所上升但差異不顯著，與前人對番茄（高茜等，2020）、紫花苜蓿（陳勝萍等，2017）進行低溫處理的研究結果相似，表明在低溫脅迫下葛藤幼苗膜脂過氧化程度低，受氧化損傷程度較弱，低溫未對葛藤造成明顯的膜脂過氧化損傷，說明葛藤具有較強的抗寒能力。

本研究中，葛藤幼苗葉片的SOD、POD、APX活性均隨溫度的降低而升高，低溫脅迫下葛藤葉片中CAT活性雖然表現為下降趨勢，但與CK差異并不顯著，CAT活性始終保持在較高水平。SOD是植物重要的保護酶系統，同時也是保護酶系統的第一道防線，能將毒性較強的轉化為毒性較弱的H2O2（高茜等，2020）；但H2O2過量累積仍會對細胞造成傷害，所以轉化的H2O2需通過CAT和POD等其他抗氧化酶清除。本研究中葛藤幼苗葉片的CAT活性呈下降趨勢，會使H2O2清除能力降低，可能造成H2O2的積累，使得膜系統遭受活性氧物質積累的傷害，但葛藤在低溫下POD活性與CK相比有明顯上升，說明POD清除過氧化氫的調控機制已形成，能在一定程度上幫助葛藤幼苗調節細胞膜透性，防止膜受損傷，從而提高葛藤幼苗的低溫適應能力，與周福平等（2020）對高粱的研究結果相同。根據研究結果及葛藤接受低溫處理后的生長發育情況來看，葛藤幼苗并未出現嚴重損傷及死亡，表明可能是低溫下葛藤幼苗葉片的SOD、POD、CAT和APX等保護酶的綜合耐低溫機制已形成，活性氧等各種自由基積累減少，細胞內活性氧代謝處于一定的平衡狀態，膜脂過氧化作用得到緩解，降低了細胞膜的破壞程度，即葛藤可通過調整自身的保護酶系統來增強其耐低溫性。

3.3 低溫脅迫對葛藤幼苗內源激素的影響

植物激素是由植物體自身代謝產生的一類有機活性化合物，數量很少，自產生部位運輸到作用部位，在很低濃度時就能發揮顯著生理效應（丁廣文等，2016）。本研究中，隨著溫度下降，葛藤幼苗葉片的ABA、GA3和ZT含量先上升后下降，IAA含量不斷下降。與周錦業等（2020）的研究結果相似，可能是由于低溫脅迫引發植物體內滲透調節的改變，葛藤為抵抗低溫帶來的傷害從而增加抑制類內源激素如ABA的含量，以增強自身耐低溫性。而GA3和IAA有加速細胞分裂、促進成熟細胞伸長的作用（袁夢佳等，2021），被認為是生長促進類激素。GA3還可通過影響植物體內自由水和束縛水的含量來改變其抗冷性（許耀照等，2020）。葛藤在低溫下通過降低體內IAA和GA3含量，抑制植物生長，增強了自身的抗冷性。本研究結果表明葛藤幼苗為抵御低溫脅迫帶來的不利影響，通過增加體內生長抑制類激素，降低生長促進類激素的含量，以此來增強自身的抗冷性。

3.4 低溫脅迫對葛藤幼苗生長發育及生理生化變化的綜合評價

對葛藤幼苗的形態指標和生理指標進行相關分析，發現生長速度與MDA含量呈顯著負相關。植物在遭遇低溫脅迫時，膜脂過氧化產物MDA會大量積累（蔣安等，2010），MDA積累會對細胞，特別是細胞膜造成一定傷害。本研究結果表明，當葛藤幼苗遭受低溫脅迫時，MDA含量不斷上升，對植株生長造成了不良影響。干鮮比與相對電導率和可溶性糖含量呈顯著正相關，說明植物水分的減少和干物質的積累會對相對電導率上升起重要作用，可溶性糖含量增加與細胞滲透勢調節密切相關。通過對各個材料主成分值進行比較，可了解不同樣本間的差異（于鳳瑤等，2010）。本研究對葛藤生長性狀的主成分分析發現，前6個主成分對表型變異的累計貢獻率達92.863 %。根據各主成分的特性，可將6個主成分分為三大類，第一類是產量性狀，比如第1主成分中的生長速度、葉面積和周長等，主要反映低溫脅迫下葛藤生長發育變化，在低溫脅迫下葛藤產量性狀呈下降趨勢；第二類是保護酶活性，如主成分中貢獻率較大的MDA、SOD、APX、CAT活性，細胞內抗氧化酶活性及膜保護物質含量越高，植物的抗冷性越強，說明幼苗受到的傷害程度越小，與馮昌軍等（2005）對苜蓿進行低溫脅迫的研究結果相似；第三類是內源激素，如IAA、GA3等，內源激素在主成分累計貢獻率占比較高，說明內源激素對植物抗冷性調節具有重要意義。

結合形態、生理指標及隸屬函數進行分析，低溫處理下隸屬函數值呈下降趨勢，葉片也出現輕微萎焉、收縮，說明低溫對葛藤幼苗的生長產生了一定的脅迫作用；最低的函數值出現在LD處理下，而并非在SD處理，對比2個處理下隸屬函數平均值，分別為3.82和3.83，并無明顯差異。可溶性糖等滲透調節物質含量上升，SOD、POD等保護酶活性上升，MDA等膜脂過氧化物質積累較少，說明葛藤具有一定的抗冷性。綜合上述分析，雖然低溫會對葛藤生長造成影響，但遭遇低溫時，葛藤會通過減緩自身生長、降低水含量、提高保護酶活性等一系列措施來抵御低溫帶來的不利影響，抗冷性較強，具有在低溫下存活的能力。但本研究只是基于植物生理和激素水平對葛藤的耐低溫性進行探討，今后還應結合不同產地、不同生長階段、不同低溫脅迫時間對植株生長性狀的差異和當地地理環境進行綜合探討與研究，以期選育出抗冷性強、適合在西南地區栽培的葛藤品種。

4 結論

葛藤幼苗在低溫下MDA增加不明顯，可溶性糖含量和各種保護酶活性升高，生長促進類激素含量降低，生長抑制類激素含量增加。低溫下葛藤生長減緩，但并未出現明顯損傷，表明葛藤幼苗可通過增強滲透調節能力、提高保護酶活性、調節激素含量來提高自身抗冷性，進而抵御低溫脅迫帶來的不利影響。