雙重血漿分子吸附對(duì)百草枯中毒肝臟損傷的作用機(jī)制研究

蘭薇 呂敏清 朱常青 張櫻華

廣州市第十二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州 510620

百草枯致死劑量小，人體吸入后可迅速吸收于各大器官，對(duì)肝臟可造成不可逆的傷害，中毒后病死率極高［1］。組合式血液凈化是目前常見的治療方法，如血液灌流+血液濾過或?yàn)V過透析治療，對(duì)患者中毒所致肝損現(xiàn)象起到一定的緩解效果，挽回部分患者生命，證實(shí)百草枯中毒患者使用組合式血液凈化安全有效［2］。目前，在臨床上應(yīng)用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療百草枯中毒致多臟器功能損傷的報(bào)道極少見。在本研究中，筆者采用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療百草枯所致肝功能衰竭患者；一方面，探討雙重血漿分子吸附對(duì)百草枯中毒患者血清炎性因子、肝功能及免疫功能的影響；另一方面，探討雙重血漿分子吸附對(duì)百草枯中毒患者肝功能的保護(hù)作用，并探討其保護(hù)作用機(jī)制是否與下調(diào)miR-155并激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)，為開發(fā)相關(guān)藥物防治百草枯所致肝功能損傷提供理論依據(jù)。

資料與方法

1、研究資料

對(duì)2020年6月至2021年6月廣州市第十二人民醫(yī)院急診收治的40例急性百草枯中毒患者的臨床治療資料進(jìn)行回顧性分析，將患者按不同血液凈化方案分為觀察組（20例）和對(duì)照組（20例）。觀察組男14例，女6例，年齡21～73（36.7±13.8）歲；服毒量10～40 ml；中毒時(shí)間20 min～8 h。對(duì)照組男12例，女8例，年齡20～71（36.2±13.5）歲；服毒量10～40 ml；中毒時(shí)間20 min～8 h。研究對(duì)象或其親屬對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合急性百草枯中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵經(jīng)口中毒，服毒量在50 ml內(nèi)；⑶服毒到就醫(yī)時(shí)間<8 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者及家屬不同意血液凈化治療；⑵入院后48 h內(nèi)死亡；⑶混合其他藥物中毒者；⑷既往惡性腫瘤、心（腦）血管疾病、血液疾病、腎衰竭等惡性疾病者。

2、研究方法

2.1、觀察組 在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上采用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療。采用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療前靜脈注射地塞米松（廣州白云山天心制藥股份有限公司，5 mg/支，針劑）5 mg防止過敏，開放體外股靜脈通路，予肝素（華北制藥股份有限公司，2 ml∶12 500 U，2 ml/支）100 mg及生理鹽水3 000 ml行模型血漿分離器、血液灌注器、膽紅素吸附器進(jìn)行預(yù)沖洗，后將靜脈回血端與血漿分離的出漿端接通。按照患者凝血功能進(jìn)行肝素劑量調(diào)節(jié)，并參照壓力監(jiān)測(cè)情況適當(dāng)追加肝素，確保患者全身肝素化。建立體外循環(huán)，靜脈端采用魚精蛋白（北京悅腹凱悅制藥有限公司，5 ml∶50 mg，50 mg/支）中和，分離血漿，血液泵的初始速率控制在80～100 ml/min，5 min后將血漿泵速率調(diào)整為30～50 ml/min，并確保血液速率120～150 ml/min。血漿分離后采用DX350膽紅素吸附柱實(shí)施吸附，再采用HA330-Ⅱ血液灌注器實(shí)施吸附，再經(jīng)靜脈端將其回輸至患者機(jī)體內(nèi)，血漿處理量為6 L，平均治療時(shí)間為3 h，3～5次為1個(gè)療程，2個(gè)療程間隔3 d。

2.2、對(duì)照組 單純使用血液灌流治療，在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上立即進(jìn)行血液灌流治療，采用一次性血液灌流器HA330（健帆公司），每天1次，每次灌流治療約2 h，3次為1個(gè)療程。兩組均治療2個(gè)療程后對(duì)比觀察指標(biāo)變化情況。

3、觀察指標(biāo)

觀察兩組患者以下各指標(biāo)入院8 h、治療后第3天、或治療后第6天的變化：炎癥因子［白細(xì)胞介素（IL）-10、IL-17、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子（TGF）-β、CRP、IL-6、腫 瘤 壞 死 因 子（TNF）-α］，肝功能［丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBil）、直接膽紅素（DBil）］，T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+），定血清miR-155、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）及其下游基因GCLC、苯醌氧化還原酶（NQO1）和血紅素氧化酶1（HO-1）。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，采用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、對(duì)患者血清炎性因子的影響

入院8 h，兩組患者IL-10、IL-17、TGF-β、CRP、IL-6、TNF-α均高于正常值，且觀察組顯著低于對(duì)照組（均P<0.05）；治療后第3、6天，兩組IL-10、IL-17、TGF-β、CRP、IL-6、TNF-α水平均呈逐漸下降趨勢(shì)，且觀察組下降更為明顯（均P<0.05）；見表1。

表1 兩組百草枯中毒患者血清炎性因子的變化（±s）

表1 兩組百草枯中毒患者血清炎性因子的變化（±s）

注：觀察組（20例）在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上采用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療，對(duì)照組（20例）在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行血液灌流治療；IL-10為白細(xì)胞介素-10，IL-17為白細(xì)胞介素-17，TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子-β，CRP為C反應(yīng)蛋白，IL-6為白細(xì)胞介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α

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2、對(duì)百草枯中毒患者肝功能的保護(hù)作用

入院8 h后，兩組患者ALT、TBil、DBil水平均高于正常值，且觀察組則著低于對(duì)照組（均P<0.05）；治療后第3、6天，兩組ALT、TBil、DBil水平均呈逐漸下降趨勢(shì)，且觀察組下降更為明顯（均P<0.05）；見表2。

表2 兩組百草枯中毒患者肝功能指標(biāo)的變化（±s）

表2 兩組百草枯中毒患者肝功能指標(biāo)的變化（±s）

注：觀察組（20例）在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上采用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療，對(duì)照組（20例）在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行血液灌流治療；ALT為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TBiL為總膽紅素，DBil為直接膽紅素

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3、T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)變化

入院8 h，兩組CD4+、CD8+水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；治療后第6天，兩組CD4+、CD8+水平均低于入院8 h，組內(nèi)比較（觀察組t=6.816、5.517，均P<0.001；對(duì)照組t=2.415、2.069，P=0.020、0.045）；治療后6 d，觀察組CD4+、CD8+水平均低于對(duì)照組（均P<0.05）。見表3。

表3 兩組百草枯中毒患者T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+指標(biāo)的變化（%，±s）

表3 兩組百草枯中毒患者T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+指標(biāo)的變化（%，±s）

注：觀察組（20例）在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上采用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療，對(duì)照組（20例）在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行血液灌流治療；CD4+為CD4+T淋巴細(xì)胞，CD8+為CD8+T淋巴細(xì)胞。

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4、兩組Nrf2、miR-155、GCLC、HO-1、NQ01水平的變化

百草枯中毒肝臟損傷患者在入院8 h Nrf2、miR-155、HO-1、NQ01均處于高表達(dá)水平，治療后第6天，兩組miR-155明顯低于入院8 h時(shí)（觀察組t=18.109，P<0.001；對(duì)照組t=2.336，P=0.024），Nrf2與HO-1、NQ01則高于入院8 h時(shí)（觀察組t=24.400、7.390、49.193，均P<0.001；對(duì)照組t=10.846、2.296、14.264，P<0.001、=0.027、<0.001）；治療后第6天，觀察組miR-155、Nrf2、HO-1、NQ01的表達(dá)均明顯優(yōu)于對(duì)照組（均P<0.05）。見表4。

表4 兩組百草枯中毒患者Nrf2、miR-155、GCLC、HO-1、NQ01水平的變化（±s）

表4 兩組百草枯中毒患者Nrf2、miR-155、GCLC、HO-1、NQ01水平的變化（±s）

注：觀察組在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上采用雙重血漿分子吸附系統(tǒng)治療，對(duì)照組在常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行血液灌流治療；miR-155為miRNAs基因，Nrf2為核因子E2相關(guān)因子2，NQO1為苯醌氧化還原酶，HO-1為血紅素氧化酶1

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討 論

目前，臨床上缺乏百草枯中毒特異性解毒藥物，對(duì)百草枯中毒患者的治療，以阻止毒物繼續(xù)吸收并對(duì)已吸收毒物及時(shí)有效清除為救治關(guān)鍵，同時(shí)對(duì)各臟器損傷情況進(jìn)行及時(shí)、積極的有效對(duì)癥干預(yù)治療，以期提高患者存活率［3-4］。早期血液凈化是目前常用的有效清除患者血液中毒物的治療手段，可將患者血液中百草枯成分迅速清除。其中血液灌流是目前公認(rèn)有效的百草枯早期血液凈化治療手段，但單一的血液灌流易出現(xiàn)飽和現(xiàn)象［5］。近年有文獻(xiàn)報(bào)道組合式血液凈化取得了極好的治療效果，即用血液灌流聯(lián)合血液濾過或?yàn)V過透析等進(jìn)行血液凈化，其效果均優(yōu)于單一手段的血液凈化治療，組合式血液凈化在百草枯中毒救治中的有效性及安全性均得到了證實(shí)［6-7］。因此，充分利用現(xiàn)有的血液凈化技術(shù)，根據(jù)各種技術(shù)的特點(diǎn)結(jié)合患者中毒劑量、時(shí)間以及患者中毒后各器官的功能狀態(tài)等，選取合適的血液凈化方式，對(duì)百草枯中毒患者來說極為重要。

肝臟是人體主要解毒器官，也是百草枯中毒損傷的主要靶器官之一。百草枯中毒可致患者肝臟出現(xiàn)組織淤血、炎癥浸潤及變性壞死，最終走向肝臟衰竭而亡，因此，百草枯所致的肝功能損傷也是PQ中毒患者高病死率的主要因素之一［8］。百草枯致肝損傷的機(jī)制目前尚未有明確結(jié)論，臨床上則以中毒后機(jī)體氧化應(yīng)激引發(fā)一系列反應(yīng)，如促進(jìn)炎性介質(zhì)的表達(dá)等，是形成肝功能損傷的多數(shù)分子途徑和發(fā)病機(jī)制的最終結(jié)果，從而導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)不同程度的損傷［9-10］。因此，研究肝功能損傷中抗氧化的調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的作用。雙重血漿分子吸附系統(tǒng)是近來臨床研究的新熱點(diǎn)，其為結(jié)合DX350膽紅素吸附柱與HA330-Ⅱ血液灌流器的一種組合式血液凈化手段，該技術(shù)在吸附膽紅素、膽汁酸以及吸附炎性介質(zhì)、IL-6及IL-10等中大分子毒素方面具有顯著的特異性，能迅速有效清除膽紅素及炎性介質(zhì)等有害物質(zhì)，減輕炎性反應(yīng)，改善免疫反應(yīng)，從而改善患者的肝臟功能。本次研究我們通過臨床實(shí)踐，探討雙重血漿分子吸附對(duì)百草枯中毒肝臟損傷患者血清炎性因子、肝功能、免疫功能等的影響。對(duì)患者血清炎性因子觀察結(jié)果表明：入院8 h后，兩組患者IL-10、IL-17、TGF-β、CRP、IL-6、TNF-α均高于正常值，說明百草枯人體吸收后可迅速發(fā)過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，機(jī)體即啟動(dòng)炎癥應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為炎性因子迅速大量釋放。使用雙重血漿分子吸附血液凈化的觀察組血清炎性因子表達(dá)在患者入院8 h及治療后第3、6天均明顯低于單純使用血液灌流治療的對(duì)照組（均P<0.05），兩組T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+水平治療后第6天均低于入院8 h時(shí)（均P<0.05），且觀察組更為明顯（均P<0.05）；說明雙重血漿分子吸附清除百草枯成分更為快速，其特有的炎性介質(zhì)吸附功能及膽紅素等有害物質(zhì)吸附功能，使膽紅素、炎性介質(zhì)等得以迅速有效地清除，使炎性因子生成大大減少，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，使機(jī)體抗氧化能力得到增強(qiáng)，改善免疫反應(yīng)，從而避免肝臟功能進(jìn)一步受損。結(jié)果證實(shí)，使用雙重血漿分子吸附治療后觀察組患者ALT、TBil、DBil水平均下降40%～45%，明顯優(yōu)于單純血液灌流治療的對(duì)照組（均P<0.05），說明雙重血漿分子吸附在清除膽紅素等有害物質(zhì)方面效果更優(yōu)，能更有效地減輕患者肝臟損傷現(xiàn)象，有效改善肝臟功能。

miR-155是一種重要的miRNAs，通過靶蛋白相關(guān)信號(hào)通路的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響細(xì)胞的生長、分化、凋亡等功能，可調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、腫瘤與移植排斥及耐受等。百草枯中毒機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)miR-155表達(dá)增加，引起肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡、氧化損傷并抑制Nrf2信號(hào)通路［11］。Nrf2可啟動(dòng)、調(diào)控下游如HO-1等基因的表達(dá)，HO-1是人體極其重要的抗氧化保護(hù)性蛋白，是機(jī)體典型的保護(hù)和防御體系。機(jī)體正常狀態(tài)下Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子（Keap l）結(jié)合處于抑制狀態(tài)，在細(xì)胞中表達(dá)非常低，但當(dāng)Nrf2受到刺激時(shí)，即迅速與Keap l解體并與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，對(duì)下游基因如HO-1、NQ01等進(jìn)行調(diào)控，從而保護(hù)機(jī)體抵抗內(nèi)生性和外源性應(yīng)激，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力［12］。Nrf2通路可產(chǎn)生抗氧化、抗炎、減輕Ca2+超載等作用，在肝功能損傷中具有重要的作用。雙重血漿分子吸附有效降低患者氧化應(yīng)激，從而顯著降低氧化應(yīng)激引起的miR-155表達(dá)，從而激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界刺激的抵抗力。本研究觀察結(jié)果也證實(shí)，本組百草枯中毒肝臟損傷患者在入院8 h的Nrf2、miR-155均處于高表達(dá)水平，治療后第6天，觀察組miR-155顯著低于入院8 h時(shí)（均P<0.05），Nrf2與HO-1、NQ01則顯著高于入院8 h時(shí)（均P<0.05），觀察組miR-155、Nrf2、HO-1、NQ01的表達(dá)均明顯優(yōu)于對(duì)照組，結(jié)合觀察組治療6 d肝功能顯著優(yōu)于對(duì)照組這一結(jié)果，說明雙重血漿分子吸附對(duì)百草枯中毒患者肝功能的保護(hù)作用應(yīng)與通過下調(diào)miR-155并激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突