超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藻類保健食品中節(jié)球藻毒素

李 碩，李 莉

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

節(jié)球藻毒素（Nodularin，NOD）是由泡沫節(jié)球藻（Nodularia spumigena）產(chǎn)生的具有強(qiáng)烈肝毒性的藍(lán)藻毒素，具有強(qiáng)烈的基因毒性、胚胎毒性和遺傳毒性，長期接觸會增加癌癥患病的風(fēng)險[1-6]。節(jié)球藻毒素為環(huán)狀五肽，分子結(jié)構(gòu)式見圖1。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）公布的致癌物分級清單將節(jié)球藻毒素列為3類致癌物[7]。

圖1 節(jié)球藻毒素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of nodularin

近年來，以螺旋藻為代表的藻類保健食品，因富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、膳食纖維、不飽和脂肪酸、礦物元素及多種生理活性物質(zhì)，日益受到消費(fèi)者的關(guān)注和青睞[8-9]。除螺旋藻外，我國目前已批準(zhǔn)的藻類保健食品原料還包括小球藻、鹽藻、雨生紅球藻等[8]。由于可用于保健食品原料的藻類養(yǎng)殖水域可能有其他藻類（如微囊藻、節(jié)球藻等）與其共生，因此這些保健食品原料存在被其他藻類所產(chǎn)生毒素污染的風(fēng)險[8,10]。此外，節(jié)球藻毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，即使加熱煮沸都難以破壞其結(jié)構(gòu)，在藻類保健食品加工過程中，如果質(zhì)量控制不嚴(yán)格，很有可能將節(jié)球藻毒素傳遞至終產(chǎn)品，對消費(fèi)者身體健康造成潛在危害[10-12]，存在潛在安全風(fēng)險。截至目前，我國尚未出臺食品中節(jié)球藻毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，GB 19643-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 藻類及其制品》[13]、GB/T 16919-1997《食用螺旋藻粉》[14]均未規(guī)定節(jié)球藻毒素的檢驗項目。為有效開展藻類保健食品中的安全風(fēng)險評估，準(zhǔn)確識別保健食品中節(jié)球藻毒素的污染程度，有必要建立藻類保健食品中節(jié)球藻毒素含量的測定方法。

目前節(jié)球藻毒素的測定分析方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定法[15-16]、高效液相色譜法[17-18]、液相色譜-質(zhì)譜法[18-31]等方法，主要集中在水質(zhì)監(jiān)測等環(huán)境領(lǐng)域[18-27]以及水產(chǎn)品安全領(lǐng)域[28-32]，有關(guān)藻類保健食品中節(jié)球藻毒素污染情況的研究較少[26-27]，檢測方法靈敏度較差。本研究采用固相萃取樣品前處理技術(shù)，并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立藻類保健食品中節(jié)球藻毒素的檢測方法。該方法旨在建立簡便、快速、靈敏度高的檢測方法，對了解藻類保健食品中節(jié)球藻毒素污染水平及潛在安全風(fēng)險具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節(jié)球藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.21 μg/mL） 青島普瑞邦公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；甲酸（質(zhì)譜純） 美國Sigma公司；Captiva EMR-Lipid Cartridge（3 mL） 美國 Agilent公司；DisQuE tube（含 150 mg 硫酸鎂、25 mg PSA、30 mg C18和30 mg中性氧化鋁） 美國Waters公司；SHIMSEN QuEChERSdSPE column（含 150 mg硫酸鎂、25mg PSA、25 mg C18） 日本Shimadzu公司；螺旋藻及小球藻等藻類保健食品，包括片劑、膠囊和藻粉 均購自網(wǎng)絡(luò)平臺。

LCMS-8060型超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源（ESI）及LabSolutions（Version 5.99 SP2）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 日本Shimadzu公司；AL 204型分析天平和XP205型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Vortex Genie 2渦旋混勻器美國Scientific Industries公司；GTR21-1B醫(yī)用離心機(jī) 北京新時代北利醫(yī)療器械有限公司；Arium?pro VF超純水純化系統(tǒng) 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取 樣品稱量前根據(jù)不同劑型進(jìn)行初步處理，其中固體片劑用杵和研缽磨成細(xì)粉末；膠囊打開后倒出內(nèi)部粉末；藻粉無需做進(jìn)一步處理。準(zhǔn)確稱取進(jìn)行初步處理后的樣品0.5 g（精確至0.0001 g）樣品置于15 mL離心管中，加入5 mL提取溶液（甲醇:水=80:20，v/v），旋渦振蕩 30 s，在 4 ℃ 條件下，8000 r/min離心5 min。

1.2.2 凈化

1.2.2.1 凈化柱凈化 取1.2.1提取步驟中所得上清液 1 mL，經(jīng) Captiva EMR-lipid 凈化柱凈化，0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為待測溶液。

1.2.2.2 凈化管凈化 取1.2.1提取步驟中所得上清液1 mL，置于DisQuE或SHIMSEN QuEChERSdSPE凈化管中渦旋混合1 min，在4 ℃條件下，8000 r/min離心5 min。上清液經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜過濾后待測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取節(jié)球藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用50%的甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg/L的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。取中間標(biāo)準(zhǔn)溶液適量置于10 mL容量瓶中，用50%的甲醇水溶液稀釋得到質(zhì)量濃度分別為 0.5、1、5、10、25和 50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Infinity Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：A 為含有0.01%甲酸的水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序 ：0～3 min，25%～50%B；3～5 min，50%～90%B；5～5.6 min，90%B；5.7～7 min，25%B；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；正離子掃描模式；檢測模式采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；霧化氣流量為 3 L/min，干燥氣（氮氣）流量為10 L/min，加熱氣（空氣）流量為10 L/min，碰撞氣為氬氣，離子源接口溫度為300 ℃，接口電壓為4.0 kV。質(zhì)譜采集時間為2.5～4 min。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.5 樣品測定 通過采用本研究方法，對39批次螺旋藻及小球藻等藻類保健食品樣品進(jìn)行檢測，所有樣品均未檢出節(jié)球藻毒素。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)通過島津LabSolutions軟件采集，導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)后采用OriginPro 2016計算和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度為50 μg /L節(jié)球藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)質(zhì)譜分析，得到目標(biāo)化合物的母離子。通過對比目標(biāo)化合物在正、負(fù)離子模式下的響應(yīng)值發(fā)現(xiàn)，節(jié)球藻毒素在正離子模式下響應(yīng)較高，因此選擇正離子掃描模式。隨后通過優(yōu)化電壓及碰撞能，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的2對離子，其中m/z：825.4＞135.2作為定量離子對，m/z：825.4＞227.3作為定性離子對。優(yōu)化后的節(jié)球藻毒素母離子、子離子及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 節(jié)球藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of nodularin

2.2 色譜條件的選擇

由于選擇正離子模式掃描，在流動相中加入適量的酸有助于提高目標(biāo)物質(zhì)的離子化效率，因此選擇0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相體系，梯度洗脫。樣品經(jīng)提取和凈化處理后上機(jī)測定，不同凈化方式下的節(jié)球藻毒素MRM譜圖見圖2。由圖2可知，采用不同凈化方式凈化后測定，節(jié)球藻毒素色譜峰周圍無明顯干擾，說明該色譜條件選擇性良好。

圖2 不同凈化方式下節(jié)球藻毒素MRM譜圖Fig.2 MRM spectra of nodularin under different purification conditions

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑和凈化方式的優(yōu)化 本研究比較了6種提取溶劑的提取效果以及3種凈化方式的凈化效果。加標(biāo)樣品分別采用甲醇溶液比例分別為50%（v/v）、60%（v/v）、70%（v/v）、80%（v/v）、90%（v/v）以及純甲醇等6種提取溶劑提取。然后再分別經(jīng)Captiva EMR-Lipid Cartridge、DisQuE tube和 SHIMSEN QuEChERSdSPE column 3種凈化裝置凈化后上機(jī)測定，加標(biāo)回收率結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溶劑對節(jié)球藻毒素回收率的影響（n=3）Fig.3 Effects of extraction solvent on recoveries of nodularin（n=3）

實驗結(jié)果表明，不同凈化裝置對同一提取溶劑的凈化效果存在較大差異：當(dāng)采用SHIMSEN QuEChERSdSPE column進(jìn)行凈化時，所比較的6種提取溶劑均能取得較好的效果，滿足回收率在80%～120%之間；當(dāng)采用Captiva EMR-Lipid Cartridge進(jìn)行凈化時，隨著提取溶劑中甲醇的比例上升，節(jié)球藻毒素的回收率先提高后降低；當(dāng)采用DisQuE tube進(jìn)行凈化時，隨著提取溶劑中甲醇的比例上升，節(jié)球藻毒素的回收率先提高后降低。當(dāng)提取溶劑中甲醇的比例為80%（v/v）或90%（v/v）時，3種凈化裝置都能取得較好的效果，均滿足回收率在80%～120%之間的需求。當(dāng)僅考慮提取效果、凈化效果以及方法凈化裝置的通用性時，提取溶劑中甲醇的比例為80%（v/v）或90%（v/v）均可作為候選的提取溶劑。但當(dāng)甲醇的比例由80%（v/v）提升為90%（v/v）時，隨著甲醇所占比例的增加，凈化后的待測溶液顏色明顯加深，進(jìn)樣后液相小瓶瓶蓋留有綠色物質(zhì)殘留，表明隨著提取溶液中甲醇比例增加，樣品中更多的色素成分被提取出來進(jìn)入待測液中。考慮到色素成分的增加不僅會增大對目標(biāo)物質(zhì)檢測的干擾，而且還會污染進(jìn)樣裝置和質(zhì)譜系統(tǒng)，因此本實驗最終選擇80%甲醇水溶液（v/v）作為提取溶劑。在實際應(yīng)用中，可以根據(jù)實驗室所在單位對選擇供應(yīng)商的政策要求、不同凈化方式操作熟練程度，以及不同廠家凈化管（柱）的送貨期、價格等因素靈活選擇。

2.3.2 提取方式的優(yōu)化 在空白基質(zhì)中加入節(jié)球藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液25 μL和提取溶劑后，分別采用渦旋提取30 s或超聲5、10、20、30 min提取的方式進(jìn)行提取，經(jīng)Captiva EMR-Lipid凈化管凈化后上機(jī)測定，通過計算加標(biāo)回收率考察不同提取方式的提取效率（結(jié)果見表2），并對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。從結(jié)果可以看出，采用渦旋和超聲不同時間提取的回收率均滿足檢測要求；方差分析計算得到F=1.346，F(xiàn)crit=3.478，F(xiàn)＜Fcrit，表明幾種提取方式之間無顯著差異。但是實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著提取時間的延長，樣品提取溶液顏色變深，說明有更多的色素等雜質(zhì)被提取出來。為了減少雜質(zhì)對質(zhì)譜的污染，試驗最終選擇采用渦旋30 s的提取方式。

表2 不同提取方法時節(jié)球藻毒素的回收率和精密度Table 2 Recoveries and precisions of nodularin in different extraction method

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用質(zhì)譜分析時，基質(zhì)中的共提取物可能會對待測節(jié)球藻毒素儀器響應(yīng)值產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)作用，從而導(dǎo)致含量測定偏高或偏低，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過對比基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（kM）與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（kS）的相對值，可以考察樣品基質(zhì)對節(jié)球藻毒素定量分析結(jié)果的影響，期量化評價待測樣品基質(zhì)對待測組分的影響。當(dāng)（1-kM/kS）×100%為正值時，則表示基質(zhì)對待測組分存在抑制作用；當(dāng)（1-kM/kS）×100%為負(fù)值時，則表示基質(zhì)對待測組分存在增強(qiáng)作用；當(dāng)（1-kM/kS）×100%為零時，則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。具體操作：稱取空白藻粉樣品，用提取液提取并經(jīng)凈化后用于配制節(jié)球藻毒素濃度為0.5、1、5、10、20和 50 μg/L 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；同時用甲醇配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別進(jìn)樣測定、讀取峰面積、擬合工作曲線并計算曲線斜率，可得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（kM）數(shù)值與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（kS）數(shù)值分別為17188和17394。按照式（1）對基質(zhì)效應(yīng)影響進(jìn)行評價：

計算結(jié)果表明，與純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，在空白樣品基質(zhì)溶液對節(jié)球藻毒素質(zhì)譜響應(yīng)值的抑制效應(yīng)約為1.2%。基質(zhì)干擾對節(jié)球藻毒素質(zhì)譜檢測影響較小，采用純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)工作曲線可以滿足定量測定要求。

2.5 線性關(guān)系考察

分別取1.2.5中的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各5 μL按上述條件測定，以目標(biāo)物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=17394X+13267。結(jié)果顯示，節(jié)球藻毒素含量在0.5～50 μg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（r）為0.9997，線性關(guān)系良好。當(dāng)樣品稱樣量0.5 g時，以3倍信噪比（S/N=3）確定化合物的檢出限（limit of detection，LOD）為 1 μg/kg、10倍信噪比（S/N=10）確定化合物的定量限（limit of quantification，LOQ）為 3 μg/kg。

2.6 加標(biāo)回收率與精密度

分別在不含節(jié)球藻毒素的螺旋藻粉中，添加10、50和250 μg/kg低、中、高3個濃度水平的節(jié)球藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，計算平均回收率（n=6）及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD），結(jié)果見表3。結(jié)果表明，節(jié)球藻毒素在3個添加水平下的平均回收率范圍在103.6%～114.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～12.5%，從整體上看，該方法準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性良好，能夠滿足日常檢測要求。

表3 不同添加水平下節(jié)球藻毒素的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precisions of nodularin at three different levels (n=6)

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取方法對樣品進(jìn)行凈化，并結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了藻類保健食品中節(jié)球藻毒素的檢測方法，通過對提取溶劑和凈化條件的優(yōu)化，樣品經(jīng)甲醇-水（80:20, v/v）混合振蕩提取，經(jīng)凈化柱或凈化管凈化，在優(yōu)化后的儀器條件下，節(jié)球藻毒素在線性范圍0.5～50 μg/L上具有良好的線性關(guān)系，檢出限為 1 μg/kg，定量限為 3 μg/kg，在低、中、高3個濃度下的平均加標(biāo)回收率為103.6%～114.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～12.5%。通過應(yīng)用本方法對39批市售藻類保健食品樣品進(jìn)行檢測，所有樣品均未檢出節(jié)球藻毒素。該檢測結(jié)果表明：我國藻類保健食品中節(jié)球藻毒素的污染風(fēng)險水平較低，整體較為安全。本方法操作簡便、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以實現(xiàn)批量樣品的檢測，適合藻類保健食品中節(jié)球藻毒素的定性確證與定量檢測。