海帶巖藻聚糖的無乙醇提取工藝研究

陳艷紅，董玉婷，啜鵬杰，陳石喬昕，姜澤東,3,4, ，朱艷冰,3,4，倪 輝,3,4，鄧尚貴，李清彪,3,4

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.華僑大學實驗室與設備管理處，福建泉州 362021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建廈門 361021；5.浙江興業集團，浙江舟山 316014）

海帶（Laminaria japonica）是一種大型的可食用褐藻，營養豐富、口感良好，素有“長壽菜”和“海上之蔬”的美譽。多糖是海帶中最主要的生物活性成分之一，主要分為三種：褐藻膠、褐藻淀粉、巖藻聚糖[1-2]。巖藻聚糖（Fucoidan），又稱褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖膠等，是一種細胞間質多糖[3]。國內外學者已對巖藻聚糖進行了深入研究，闡明了其基本結構特征和生物活性。巖藻聚糖的多糖骨架主要由巖藻糖（Fucose）和硫酸基團構成，此外還含有半乳糖、甘露糖、木糖等[4]。隨著巖藻聚糖的有益生物活性及其機理不斷被闡釋，包括抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗病毒、調控腸道菌群和抗過敏等[5-10]，其在生物醫藥和食品領域的開發利用也受到越來越多的關注。目前，巖藻聚糖被歐盟批準為新食品原料，也獲得了美國食藥局（FDA）的 GRAS認證；在亞太地區，日本一直占據巖藻聚糖研究和產品開發的主要地位，廣泛運作于功能食品、醫藥品、營養補充品以及普通食品領域。

巖藻聚糖的制備工藝中最常用的是熱水浸提-乙醇沉淀法，還有酸浸提和堿浸提等提取方法[5]。近年來，超臨界萃取、酶輔助提取、微波或超聲輔助提取等方法被廣泛應用于海藻多糖的制備工藝的研究和應用[6]。目前，這些方法中酸/堿浸提、酶輔助提取、微波或超聲輔助提取等往往會破壞天然多糖的結構[5]。熱水浸提-乙醇沉淀法工藝相對簡單，對設備和場地的要求不高，并且可最大限度保留多糖的天然結構，適用于規?；a[5]。另外，上述各種方法所制備的多糖提取液都需要經過乙醇分級沉淀才能獲得巖藻聚糖。乙醇分級沉淀是利用褐藻酸、昆布多糖和巖藻聚糖在不同濃度乙醇中溶解性的差異對巖藻聚糖進行提純的方法[1]；通過50%～70%的乙醇沉淀，可以從海帶提取上清液中制備獲得初級純化的巖藻聚糖[7]。因此，在目前的巖藻聚糖的制備工藝流程中均需要使用大量的乙醇。例如，陳東慧等[5]報道的熱水浸提法制備巖藻聚糖工藝，制備1 g初級多糖制品需要使用95%的乙醇約3.2 L。乙醇的大量儲備和使用給巖藻聚糖生產帶來了嚴重的安全隱患和巨大的經濟負擔。基于此，本研究擬利用巖藻聚糖中巖藻糖和硫酸基團的含量及其有益生物活性為指標，針對傳統的巖藻聚糖的熱水浸提-乙醇沉淀制備工藝進行改進和優化，旨在獲得高品質和生物活性巖藻聚糖的無乙醇沉淀提取工藝，豐富海藻多糖提取加工和高值利用的理論基礎，為巖藻聚糖安全、高效地規模化生產提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶L.japonica采集于福建漳州東山島海帶養殖海域，晾干備用；標準單糖：L-巖藻糖（L-Fuc）美國 Sigma 公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）阿拉丁試劑（上海）有限公司；蛋白胨、LB培養基廣東環凱微生物科技有限公司；酵母粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；褐藻膠裂解酶10000 U/g 西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；其它試劑均為分析純產品。

HH-4型恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；5810R型冷凍高速離心機 德國 Eppendorf公司；FE20 型pH計 梅特勒-托利多稱重設備系統有限公司；BioTek Cytation-5細胞成像多功能檢測系統美國伯騰儀器有限公司；ZHWY-2102/ZWY-200D型雙層全溫度培養搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；1360 Infinity超高壓高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和Inert Sustain RC18色譜柱）中國安捷倫科技有限公司；iS50 FT-IR紅外光譜儀中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖藻聚糖的制備工藝 巖藻聚糖的制備采用了三種工藝，分別是熱水浸提-乙醇沉淀法、熱水浸提-酸沉法、熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法。

熱水浸提-乙醇沉淀法[8]： 將海帶清洗干凈放入烘箱干燥后粉碎過篩（60目），加入混合液（乙醇:三氯甲烷:水= 4:2:1）進行預處理，于 4 000 r·min-1離心10 min得到沉淀將其烘干，加入熱水浸提，浸提結束后離心取上清液，在上清液中加入60%乙醇沉淀巖藻聚糖粗多糖，于4 000 r·min-1離心15min得到沉淀，用純水清洗沉淀再加入0.5 mol/L NaCl清洗去除褐藻膠，繼續離心得到沉淀，用95%～100%乙醇清洗沉淀后干燥獲得巖藻聚糖（樣品1）。

熱水浸提-酸沉淀法：參照文獻[8]所報道的方法，去除最終乙醇分級沉淀巖藻聚糖步驟。方法如下：將海帶清洗干凈放入烘箱干燥后粉碎過篩（60目），加入熱水浸提，浸提結束后于4 000 r·min-1離心10 min 取上清液加入鹽酸將pH調制1.4后高速離心（10000 r·min-1, 10 min），離心分離褐藻膠，取上清液調節pH至中性，將上清液放入透析袋中透析，透析結束后冷凍干燥獲得巖藻聚糖（樣品2）。

熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法：參照文獻[8]，將海帶清洗干凈放入烘箱干燥后粉碎過篩（60目），加入熱水浸提，浸提結束后于4 000 r·min-1離心10 min取上清液加入鹽酸將pH調制1.4后離心分離褐藻膠（10000 r·min-1，10 min），取上清液調節 pH 至中性后加入褐藻膠裂解酶（5 U/mL）50 ℃處理3 h（去除褐藻膠），酶解結束后放入水浴鍋中高溫滅酶，將上清液放入透析袋中透析，透析結束后冷凍干燥獲得巖藻聚糖（樣品 3）。

巖藻聚糖得率按以下公式計算：

巖藻聚糖得率（%）=巖藻聚糖質量/海帶粉質量×100

1.2.2 總糖含量的測定 巖藻聚糖中總糖含量采用苯酚-硫酸法進行測定[9]。巖藻聚糖烘干至恒重，配制10 mL濃度為1 mg/mL的多糖溶液。向1 mL樣品溶液和各標準溶液中加入1 mL苯酚溶液（6%），搖勻后，加入濃硫酸5 mL后迅速混勻，冷卻至室溫，在490 nm 波長下測定吸光度值。以葡萄糖為標準品，以葡萄糖濃度為橫坐標x，以吸光度值為縱坐標y，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：y=0.0365x+0.0951（R2=0.9997），據此計算樣品中總糖含量。

1.2.3 巖藻糖含量的測定 采用柱前PMP衍生法[10]衍生單糖標準品（L-Fuc）和多糖的水解產物，通過高效液相色譜（HPLC）法[10]對樣品中單糖巖藻糖組分進行定量分析。將4 mg/mL多糖溶液（或不同濃度單糖標準品溶液）與等體積的4 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液混勻后，100 ℃沸水浴4 h。冷卻至室溫后，加入1600 μL甲醇，進行真空旋轉蒸發，重復三次去除TFA。旋蒸后的樣品用800 μL蒸餾水溶解。向水解樣品中加入0.6 mol/L的等體積NaOH溶液混勻，加入1.6 mL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液并混勻，70 ℃水浴100 min。冷卻至室溫后，加入1.6 mL 0.3 mol/L的HCl溶液中和，混勻后進行旋轉蒸發。向樣品中加入800 μL的蒸餾水和800 μL的三氯甲烷，渦旋振蕩后離心去除有機相；上述步驟重復三次以充分去除溶液中未反應的PMP。獲得的水相經過0.22 μm微孔膜過濾后，進行HPLC分析。

HPLC分析條件如下：液相柱，Inert Sustain RC18色譜柱（4.6 mm I.D.×75 mm）；柱溫，30 ℃；流速，1.0 mL/min；進樣體積，50 μL；紫外檢測器波長，250 nm；洗脫液，0.2 mol/L PBS-乙腈溶液（乙腈為17%，pH=8.9）。

以單糖標準品的濃度為橫坐標x，峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=4280.1x-60.238（R2=0.9993），據此測定樣品中各單糖組分的含量。

1.2.4 硫酸基團含量的測定 巖藻聚糖中硫酸基團的含量采用氯化鋇-明膠比濁法測定[11]。準確稱取明膠0.5 g溶解于50 mL蒸餾水中，4 ℃過夜后加入0.5 g氯化鋇，靜置2 h獲得明膠-氯化鋇溶液，過0.45 μm濾膜備用。多糖在1 mol/L HCl溶液中105 ℃水解4 h，隨后加入1 mL明膠-氯化鋇溶液，充分搖勻后，在波長500 nm處測定吸光值。使用K2SO4作為標準品，以濃度為橫坐標x，吸光值為縱坐標y，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=0.0011x+0.1218（R2=0.9991），據此測定樣品中硫酸基團（）質量分數。

1.2.5 蛋白質含量的測定 巖藻聚糖中蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定[12]。將1 mL濃度為0.1 mg/mL的巖藻聚糖溶液與考馬斯亮藍溶液以1:4的比例混勻，室溫放置10 min，在波長為595 nm處測定吸光值。使用BSA作為標準品，以BSA濃度為橫坐標x，吸光度值為縱坐標y繪制標準曲線，獲得線性回歸方程為 y=0.0004x+0.1097（R2=0.9991），據此計算樣品中蛋白質含量。

1.2.6 糖醛酸含量的測定 巖藻聚糖中糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法測定[13]。在冰浴條件下，向1 mL濃度為1 mg/mL的巖藻聚糖溶液中加入5 mL的四硼酸鈉-硫酸溶液，待溫度降至室溫后，再加入0.15%的咔唑-乙醇溶液，搖勻。沸水浴20 min后，冷卻至室溫，在波長為523 nm處測定吸光值。使用D-葡萄糖醛酸作為標準品，以D-葡萄糖醛酸濃度為橫坐標x，吸光度值為縱坐標y繪制標準曲線，得到線性回歸方程為 y=0.3333x+4E-16（R2=1.000），據此計算樣品中糖醛酸含量。

1.2.7 傅立葉紅外光譜分析 將巖藻聚糖樣品烘干至恒重，分別稱取1.5 mg與KBr混合，研磨均勻后壓成半透明薄片，置于iS50 FT-IR紅外光譜儀中，在4000～400 cm-1波長處進行檢測，記錄紅外光譜圖。

1.2.8.1 抗氧化活性分析 巖藻聚糖的抗氧化活性采用還原力、OH 自由基（OH·）、ABTS+自由基（ABTS+·）以及DPPH自由基的清除能力進行評價。

采用鐵氰化鉀還原法[14]測定巖藻聚糖的還原力。取0.30 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液，分別加入0.35 mL的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）和0.35 mL的 K3Fe（CN）6溶液（1%，w/v），混勻后，50 ℃ 水浴20 min。冷卻至室溫后，加入0.35 mL的三氯乙酸溶液（10%，w/v）和 0.15 mL 的 FeCl3溶液（0.1%，w/v），混勻。在波長為700 nm處測定吸光值A1。對照組為蒸餾水代替樣品測得的吸光值為A0。按照公式（1）計算巖藻聚糖的還原力，如下：

參照WANG等[15]所述的方法測定OH·清除能力。分別在離心管中按順序加入0.1 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液、0.1 mL的水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L）、0.1 mL的 FeSO4溶液（9 mmol/L）、0.1mL的 H2O2（8.8 mol/L）和0.6 mL去離子水，混勻，于37 ℃水浴反應10 min。在波長為510 nm處測定吸光值A1。對照組為蒸餾水代替樣品測得的吸光值為A0。按照公式（2）計算巖藻聚糖對OH·清除率，并計算出巖藻聚糖的半數清除率（IC50）。計算公式如下：

參照YANG等[16]所述方法測定 ABTS+·清除能力。分別取0.1 mL的不同濃度巖藻聚糖溶液與1 mL的ABTS工作液混合后，在734 nm處測定吸光值A1。對照組為蒸餾水代替樣品測得的吸光值為A0。按照公式（3）計算巖藻聚糖對ABTS+·清除率，并計算出巖藻聚糖的半數清除率（IC50）。計算公式如下：

參照LV等[17]所述方法測定DPPH自由基清除能力。分別取0.8 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液和0.8 mL的DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），混勻，室溫下避光保存0.5 h，在波長517nm處測定吸光值A1，對照組為蒸餾水代替多糖樣品測得的吸光值為A0，計算多糖樣品的DPPH自由基清除率，計算公式（4）如下：

1.2.8.2 抑菌活性分析 巖藻聚糖對大腸桿菌的抑菌活性采用比濁法[18]測定。不同濃度的巖藻聚糖溶液經0.22 μm濾頭過濾除菌，備用。取4 mL不同濃度的巖藻聚糖溶液與4 mL的LB培養基混合，巖藻聚糖的終濃度分別為 0、2、4、6、8、10 mg/mL。取20 μL細菌懸液，接種到含多糖的LB培養基中，混勻，在37 ℃的恒溫搖床中培養12 h，轉速為180 r/min。最終在波長600 nm處測定細菌懸液的吸光值A1。以無菌水替代多糖樣品為陰性對照組測得吸光值A0，陽性對照組為以卡那霉素替代多糖樣品。按照公式（5）計算巖藻聚糖對大腸桿菌的抑制活性，如下：

1.2.9 基于響應面法優化熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助提取巖藻聚糖工藝 熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取得到的巖藻聚糖的品質（巖藻糖和硫酸基團含量高）和生物活性較好。因此，基于單因素實驗和Box-Benhnken 中心組合實驗設計原理[19]，以提取過程中的關鍵因素為響應值設計實驗，利用Design-Expert 8.0.5軟件對熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖的工藝過程進行優化。

1.2.9.1 單因素實驗 以提取溫度、提取時間、液料比為因素，以巖藻聚糖得率為考察指標，考察3個因素對巖藻聚糖得率的影響。

由于共享經濟屬于新事物，正處于快速發展階段，相關政府尚未出臺相應的法律法規，對其發展的監管仍存在許多灰色地帶。現階段，仍有投機分子利用這些漏洞，破壞市場秩序而相關部門也因無法可依，不能及時處理一些違法現象，導致共享經濟發展存在小范圍惡性循環。

提取溫度對巖藻聚糖提取率的影響：固定液料比（40:1 mL/g）和浸提時間（2.0 h），考察浸提溫度在70、80、90及100 ℃條件下對巖藻聚糖提取率的影響。

提取時間對巖藻聚糖提取率的影響：固定液料比（40:1 mL/g）和浸提溫度（90℃），考察浸提時間在1.0、2.0、3.0及4 h條件下對巖藻聚糖提取率的影響。

液料比對巖藻聚糖提取率的影響：固定浸提溫度（90 ℃）和浸提時間（2.0 h），考察液料比（mg/L）在30:1、35:1、40:1及45:1條件下對巖藻聚糖得率的影響。

1.2.9.2 響應面優化試驗 在單因素實驗基礎上，采用Design Expert 8.0.6 Box-Behnken試驗設計方案，其因素與水平設計見表1。實驗因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.3 數據處理

為確保實驗的準確性和數據的可靠性，上述每組實驗進行三次獨立實驗并重復3次。實驗結果用Office 2016、SPSS 19.0和 Design-Expert 8.0.6進行處理分析，P＜0.05代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同制備工藝對巖藻聚糖得率的影響

基于文獻所報道的熱水浸提-乙醇沉淀法最佳工藝條件制備獲得的巖藻聚糖樣品1的得率為5.87%±0.23%；熱水浸提-酸沉法制備獲得的巖藻聚糖樣品2得率為9.65%±0.11%；在熱水浸提-酸沉法得到樣品2的基礎上，采用褐藻膠裂解酶處理，對樣品進一步進行純化（熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法），所得巖藻聚糖得率為6.67%±0.46%。在這三種制備方法中，熱水浸提-乙醇沉淀法利用乙醇分級沉淀，分別得到巖藻聚糖和褐藻膠，而熱水浸提-酸沉法和熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法均是利用褐藻膠不溶于稀酸溶液的特性，沉淀得到褐藻膠；熱水浸提-乙醇沉淀法制備巖藻聚糖的副產物褐藻膠得率為6.88%±0.15%，熱水浸提-酸沉淀法和熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法褐藻膠得率為10.14%±0.07%。結果表明，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備巖藻聚糖得率高于傳統的熱水浸提-乙醇沉淀法，通過酸沉法得到褐藻膠得率明顯高于醇沉法得到褐藻膠得率。

2.2 不同制備工藝對巖藻聚糖化學組成的影響

針對不同工藝制備的巖藻聚糖的化學組成包括總糖、單糖巖藻糖、硫酸基團、蛋白質和糖醛酸含量進行分析，測定結果如圖1所示。結果表明，3種樣品中，樣品3通過熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖樣品總糖含量（圖1A）最高，為68.22%±1.31%，顯著（P＜0.05）高于行業標準（SC/T 3404-2012）要求的50%；如圖1B所示，樣品3單糖巖藻糖含量（41.10%±0.87%）也高于樣品 1（32.10%±0.31%）和樣品2（36.70%±0.28%），并且顯著高于行業標準（SC/T 3404-2012）要求的15%；同樣地，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖樣品的硫酸基團含量（24.90%±0.15%）相比通過工藝一和工藝二制備的巖藻聚糖樣品的硫酸基團含量（21.10%±0.14%和22.10%±0.09%）顯著（P＜0.05）提高（圖1C），符合行業標準（SC/T 3404-2012）要求的15%；另一方面，樣品3的蛋白質含量和糖醛酸含量均低于樣品1和樣品2，分別降低至6.50%±0.04%和3.80%±0.01%，表示熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法更有利于蛋白質和糖醛酸的脫除。結果表明，不同制備工藝的巖藻聚糖樣品化學組成含量差異顯著（P＜0.05），熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖樣品品質（巖藻糖和硫酸基團含量高）相對優于熱水浸提-乙醇沉淀法和熱水浸提-酸沉法。

圖1 不同工藝制備巖藻聚糖的化學組成Fig.1 Chemical composition of fucoidan prepared by different processes

2.3 不同制備工藝對巖藻聚糖結構特征的影響

巖藻聚糖樣品1、樣品2、樣品3的紅外光譜圖如圖2所示。由圖2可知，不同工藝制備的3個樣品均在3500～3300 cm-1處出現紅外特征吸收峰，這是糖類物質共有的O-H的伸縮振動信號；2900 cm-1處的吸收峰為C-H伸縮振動的信號；在1650和1400 cm-1附近出現的吸收峰是C=O的伸縮振動引起的[7,20]。在1260 cm-1處的吸收峰為S=O的吸收峰，同時，3個多糖樣品在1260 cm-1處均有較強的吸收峰，表明其均含有硫酸基團[21]。位于1150 cm-1和1080 cm-1處吸收峰分別為C-O-C和C-OH的特征峰[22-23]。以上結果表明，不同工藝制備的3種多糖樣品的具有相似的官能團結構特征。

圖2 三種巖藻聚糖樣品的紅外光譜圖譜Fig.2 FT-IR spectroscopy infrared spectra of three fucoidan samples

2.4 不同制備工藝對巖藻聚糖抗氧化活性和抑菌活性的影響

不同制備工藝對巖藻聚糖抗氧化活性的影響如圖3所示。結果表明，在多糖濃度為0～10 mg/mL范圍內，3種巖藻聚糖的還原力隨著多糖質量濃度的升高而增強，相同濃度條件下多糖對Fe3+的還原力大小依次為樣品3＞樣品2＞樣品1（圖3A）；在0～10 mg/mL的測試濃度范圍內，巖藻聚糖對OH自由基、ABTS+自由基和DPPH自由基的清除能力均隨著多糖的質量濃度的增大而增強；樣品1、樣品2、樣品3對OH自由基的半數清除濃度（IC50）分別為8.99、6.45、4.72 mg/mL（圖3B），對ABTS+自由基的半數清除濃度（IC50）分別為 7.90、5.24、3.61 mg/mL，對 DPPH自由基的半數清除濃度（IC50）分別為5.22、2.61、1.25 mg/mL（圖3C～7D）。研究表明，巖藻聚糖的抗氧化活性受多糖的提取方法和分子量、糖苷鍵類型、硫酸基團含量及位置等結構因素的影響[24]。WANG等[25]研究了海帶中低分子量巖藻聚糖的抗氧化活性，發現硫酸基團含量與抗氧化能力之間呈正相關性，本研究結果與上述報道一致。另外，謝瑾等[26]發現用胰酶和木瓜蛋白酶酶解巖藻聚糖可顯著酶解產物的抗氧化活性，是由于酶自身催化活性及酶解位點不同，使得水解后的多糖分子量大小和分子結構存在差異，因此表現出不同的抗氧化能力。樣品3表現出較強抗氧化活性的確切原因還需要進一步研究。

圖3 巖藻聚糖抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of fucoidan

巖藻聚糖對大腸桿菌的抑制效果如圖4所示。在所測試濃度（0～10 mg/mL）范圍內，巖藻聚糖樣品1、樣品2、樣品3對大腸桿菌的抑制能力隨著多糖的質量濃度的增大而增強，其抑菌活性與多糖的濃度呈正相關。相同質量濃度條件下三種不同制備工藝制備的巖藻聚糖的抑菌活性強弱依次為樣品3＞樣品2＞樣品1，表明相比傳統的熱水浸提-乙醇沉淀法，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法制備的巖藻聚糖的抑菌活性最佳。研究表明，巖藻聚糖的抑菌活性不僅取決于多糖的分子量以及硫酸基團含量，還主要受到多糖中單糖的構成和比例及其分子構象等多重因素的影響[25]。本研究中，通過工藝三制備的巖藻聚糖其巖藻糖和硫酸基團的含量顯著高于通過工藝二和工藝一制備的巖藻聚糖，并且樣品1、樣品2和樣品3的抑菌活性隨著所含的巖藻糖和硫酸基團的含量增多而增強，推測通過工藝三制備的巖藻聚糖具有較好的抑菌活性歸因于其含有較高含量的巖藻糖和硫酸基團。

圖4 巖藻聚糖對大腸桿菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of fucoidans on Escherichia coli

2.5 熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖工藝優化

2.5.1 單因素實驗結果 固定液料比（40:1 mL/g）和浸提時間（2.0 h），考察浸提溫度對巖藻聚糖提取得率的影響。隨著浸提溫度的上升，巖藻聚糖得率逐漸升高；當溫度為90 ℃時，其得率達到最大；溫度繼續升高，其得率呈現急劇下降的趨勢（圖5A）。這是因為一定范圍內提高浸提溫度會加速海藻組織軟化膨脹，促進組織內分子運動，加速多糖的擴散，提高浸提效果[27]；當浸提溫度過高，則導致多糖的結構破壞和降解損失，從而致使巖藻聚糖得率降低[28]。因此，選取90 ℃為最適浸提溫度進行后續試驗。

固定液料比（40:1 mL/g）和浸提溫度（90 ℃），考察浸提時間對巖藻聚糖提取得率的影響。在上述最適提取溫度條件下，浸提時間為1.0～2.0 h 時，隨時間延長巖藻聚糖提取得率呈上升趨勢，2.0 h 時達到最大提取得率；浸提時間超過2.0 h 后，多糖得率隨時間增長逐漸下降（圖5B）。這是因為90 ℃條件下，浸提時間過長也會破壞多糖的結構，使多糖被降解，從而導致巖藻聚糖得率降低[29]。另外，浸提時間的延長還會使生產能耗增大。因此，選取2.0 h為浸提酶解時間進行后續試驗。

將浸提溫度和時間分別設置為上述最適條件（90 ℃和2.0 h），考察液料比對巖藻聚糖提取得率的影響。結果如圖5C所示，液料比在30:1 ～ 40:1 mL/g時，巖藻聚糖的提取得率隨液料比增大逐漸升高。研究表明增加多糖提取溶劑中水的比例可有效降低多糖溶液的黏度，從而提高提取體系中多糖溶質的濃度差，在一定程度上提高傳質推動力，可有效促進多糖分子的傳質擴散[30]。因此，在本實驗中隨著浸提體系的液料比逐漸增大，巖藻聚糖得率逐漸升高。當液料比高于40:1 mL/g 時，巖藻聚糖得率無顯著提高，因為海藻中大部分多糖已被浸提出來，因此增大提取溶劑中水的比例也不會導致多糖得率顯著提升[30]。另一方面，液料比過高會增加多糖生產制備過程中的水耗和加熱能耗，增大產品的生產成本。因此，選取40:1 mL/g為最優液料比進行后續試驗。

圖5 單因素實驗結果Fig.5 Single factor experimental results

2.5.2 響應面試驗結果 采用Design-Exper 8.0.6 軟件對表3的數據進一步進行回歸分析，得到響應值與實驗因素三元二次回歸方程：

Y=-225.24050+4.03141X1+2.07975X2+2.46483X3-0.0065X1X2-0.006665X1X3-0.019500X2X3-0.020776X12-0.16838X22-0.021805X32

用Design-Expert 8.0.6 軟件分析模型的可信度，模型的決定系數R2=0.9961,R2Adj=0.9912,R2接近于1，表明模型對響應值的預測準確，可將模型應用于實驗的分析與預測。

2.5.3 二次模型的方差分析結果 根據表1因素水平的選取和表2 的結果，用Design-Expert 8.0.6 軟件進行方差分析，該模型和模型系數的顯著性檢驗結果如表3所示。實驗獲得的模型為高度顯著水平（P＜0.0001），失擬項P=0.057，表明模型的純誤差不顯著。一次項中浸提溫度（X1）、浸提時間（X2）和料液比（X3）對巖藻聚糖得率影響均顯著（P＜0.05）；其中X1和X3對巖藻聚糖的提取得率影響達極顯著水平（P＜0.01），X3對其得率影響最大。二次項中 X1和X3對巖藻聚糖得率影響極顯著（P＜0.01）；交互項中X1X3對巖藻聚糖得率影響極顯著（P＜0.01），而X1和 X2、X2和 X3之間交互影響不顯著（P＞0.05）。綜上，研究表明三因素中對巖藻聚糖得率影響水平大小依次為液料比＞溫度＞時間，其中液料比為極顯著水平，溫度（℃）和液料比的交互作用也達到了極顯著水平。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for regression model

2.5.4 響應面因素間的交互作用分析 進一步評價提取過程中關鍵影響因素的交互作用對巖藻聚糖提取得率的影響，分別繪制了各因素交互作用影響的響應曲面和等高線，如圖6所示。圖6A是浸提時間與浸提溫度的交互作用對巖藻聚糖得率的影響，響應面發生了彎曲，表明浸提時間與浸提溫度對巖藻聚糖得率的影響不是簡單的線性關系，浸提溫度對巖藻聚糖得率的影響大于浸提時間的影響，兩個因素的交互作用對響應值影響不顯著。同樣，圖6B中響應面也發生了彎曲，表明料液比和浸提時間與巖藻聚糖得率也不是簡單的線性關系，進一步優化得到液料比對巖藻聚糖得率的影響大于浸提時間的影響，同時兩個因素的交互作用不顯著。從圖6C可以看出液料比與浸提溫度之間的交互作用顯著，以上結果與表3 回歸方程方差分析結果一致。

圖6 各因素交互作用對提取率影響的等高線和響應面圖Fig.6 Contour and response surface maps of the interaction of various factors on the extraction rate

2.5.5 響應面模型的驗證 應用響應面法優化，基于Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖的最佳工藝條件為：浸提溫度為94.78 ℃、浸提時間為1.96 h、液料比為41.13 mL/g，在此參數下巖藻聚糖得率最高為9.34%。根據實際操作條件，將優化后的浸提溫度調整為90 ℃，浸提時間為2.0 h，液料比為40 mL/g，進行驗證性實驗，獲得巖藻聚糖提取率為9.65%±0.11%，與預測值的相對誤差為2.32%，相對誤差值較小，表明回歸模型與實驗結果相符合，回歸方程能準確地反映浸提溫度、時間以及液料比對巖藻聚糖提取得率的影響，模型具有可行性。

3 結論

通過對三種方法提取得到的巖藻聚糖進行的一系列研究表明，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法所制得的樣品3具有最佳的品質以及最好的生理活性。樣品3的得率為6.67%±0.46%，總糖含量為68.22%±1.31%，巖藻糖含量為41.10%±0.87%，硫酸基團含量為24.90%±0.15%，蛋白質含量為6.50%±0.04%，糖醛酸含量為3.80%±0.01%，得到副產物褐藻膠得率為10.14%±0.07%?？寡趸嶒灲Y果表明，三種樣品的抗氧化活性強弱依次為樣品3＞樣品2＞樣品1。抑菌實驗結果表明，三種樣品抑制大腸桿菌的活性強弱依次為樣品3＞樣品2＞樣品1，進一步說明熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖可以作為一種有效替代熱水浸提-乙醇沉淀法提取巖藻聚糖的良好工藝。本研究進一步利用響應面法對熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法提取巖藻聚糖工藝中關鍵因素進行優化，獲得了巖藻聚糖最佳工藝參數，浸提溫度為90 ℃，浸提時間為2.0 h，液料比為40:1 mL/g，巖藻聚糖得率達到9.65%±0.11%。本研究中熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法的巖藻聚糖提取得率及其所制備的巖藻聚糖的生物活性顯著高于熱水浸提-乙醇沉淀法、熱水浸提-酸沉淀法制備的巖藻聚糖，熱水浸提-酸沉淀-酶解輔助法有望在今后成為一種有效替代熱水浸提-乙醇沉淀法提取巖藻聚糖的良好工藝，該工藝提高巖藻多糖提取率和品質的同時消除了乙醇帶來的安全隱患。