維生素E對β-胡蘿卜素納米乳液性質及其飲料穩定性的影響

常 旋，王根女，黃國周，張佳靚，徐春明，陳 雄,

（1.恒楓食品科技有限公司，浙江杭州 311215；2.松裕印刷包裝有限公司，浙江杭州 311215）

流行病學研究發現類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素可以降低某些癌癥、心血管疾病、黃斑病變和白內障的患病風險[1]。相關研究表明類胡蘿卜素是通過防止氧化損傷、淬滅單線態氧、改變轉錄活性以及用作維生素A的前體等生理機制給人體健康帶來諸多益處[2-3]。β-胡蘿卜素的生物利用度主要取決于食物基質，機體對植物來源的β-胡蘿卜素吸收相對較低，從而為開發用于食物強化和補充的β-胡蘿卜素產品提供了機會[4]，因此β-胡蘿卜素作為營養強化劑在食品工業中的應用引起了廣泛關注。但是，β-胡蘿卜素不溶于水，并且由于其多不飽和結構而對光、熱、異構化和降解高度敏感，成為限制其在食品和飲料中應用的主要因素[5-6]。

目前，基于乳液的遞送系統被廣泛用于封裝和保護疏水性生物活性成分，可以用于改善β-胡蘿卜素在水基產品中的溶解性，延緩氧化降解，提高穩定性[1]。而納米乳液是動力學穩定的膠體遞送系統，液滴尺寸較小，與傳統乳液相比具有更高的穩定性和溶解性[7]。影響乳液中β-胡蘿卜素降解的因素包括乳液系統的組成和環境條件，例如乳化劑、抗氧化劑、光、熱和食物系統等[8-9]。已有研究發現吐溫80和大豆卵磷脂混合作為表面活性劑，可以制備穩定的納米乳液[10]。而且當抗氧化劑以合適的濃度存在時，可以顯著抑制或延遲β-胡蘿卜素的氧化降解[2]。因此，本研究以吐溫和磷脂為乳化劑制備了一支β-胡蘿卜素納米乳液，并探究了抗氧化劑對β-胡蘿卜素穩定性的影響，研究結果將對開發用于食品、飲料行業的β-胡蘿卜素傳遞系統提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-胡蘿卜素油懸浮液 含量30%，浙江醫藥有限公司新昌制藥廠；聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯（吐溫60） 江蘇四新界面劑科技有限公司；聚氧乙烯山梨醇單油酸酯（吐溫80） Kerry集團；磷脂 嘉吉食品（天津）有限公司；辛癸酸甘油酯 杭州油脂化工有限公司；維生素E 浙江伊寶馨生物科技股份有限公司；酶處理異槲皮苷、迷迭香提取物、維生素E乳液 恒楓食品科技有限公司；維生素C 黑龍江新和成生物科技有限公司；EDTA-2Na 南通奧凱生物技術開發有限公司；丙酮、正己烷 上海凌峰化學試劑有限公司；無水乙醇 杭州雙林化工試劑有限公司。

磁力攪拌器、移液槍 艾本德中國有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司；HunterLab ColorQuest XE分光色差儀 美國Hunter Lab公司；IKA T25高速分散機德國IKA公司；APV1000均質機 斯必克流體技術有限公司；數顯恒溫水浴鍋 國華（常州）儀器制造有限公司；NanoBrook Omni粒徑分析儀 美國布魯克海文儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1β-胡蘿卜素納米乳液制備 準確稱取β-胡蘿卜素，加入辛癸酸甘油酯中，攪拌條件下加熱至β-胡蘿卜素完全溶解得到油相（10 wt%）。水相由吐溫60（3 wt%）、吐溫 80（4 wt%）、磷脂（3 wt%）、甘油（60 wt%）和水組成，充分攪拌至完全溶解。將油相添加至水相中，10000 r/min剪切10 min。剪切完成后600 bar均質3次。脂溶性抗氧化劑在β-胡蘿卜素完全溶解降溫后加入。

1.2.2 抗氧化劑選擇 在中性（不含檸檬酸和檸檬酸鈉）和酸性（水中添加8%白砂糖，0.08%檸檬酸，0.035%檸檬酸鈉）飲料中添加0.05%β-胡蘿卜素乳液。在兩種β-胡蘿卜素飲料中添加不同抗氧化劑，包括VC、VE、EDTA-2Na、迷迭香提取物和酶處理異槲皮苷。將β-胡蘿卜素飲料置于自然光下儲藏28 d并利用色差儀測定儲藏期間顏色變化，測定指標為L*、a*和b*。L*表示樣品的亮度值，a*表示樣品的紅度值，b*表示樣品的黃度值，并以b*為指標篩選合適的抗氧化劑。

1.2.3β-胡蘿卜素乳液粒徑測定 采用NanoBrooker Omni粒徑分析儀測定樣品的粒徑分布。乳狀液稀釋100倍后，在25 ℃條件下，采用173°散射角測量且折射系數為1.450，所有的測定均重復三次。

1.2.4β-胡蘿卜素乳液透光率測定 將β-胡蘿卜素乳液稀釋至0.5%后在680 nm下測定透光率。

1.2.5β-胡蘿卜素包埋率測定β-胡蘿卜素的包埋率的測定參考Hu等[11]的方法，并進行部分修改。β-胡蘿卜素乳液在10000 r/min條件下離心40 min，注射器吸取下層清液。吸取0.1 mLβ-胡蘿卜素乳液和0.1 mL離心后清液，加入2 mL無水乙醇和5 mL正己烷，渦旋1 min后，8000 r/min離心10 min，吸取上層清液后，450 nm波長下測定吸光度。β-胡蘿卜素在乳液中的包埋率由下式（1）計算：

式中：M0和M1分別表示游離β-胡蘿卜素和乳液中總β-胡蘿卜素含量。

1.2.6β-胡蘿卜素乳液色價測定 準確稱取1 g乳液，加水定容至100 mL得到稀釋液。準確移取3.0 mL上述稀釋液，并用丙酮定容至100 mL。以丙酮為空白，在450 nm下測定稀釋液的吸光度值A，色價計算公式（2）如下：

式中：A為稀釋液吸光度值；m為乳液質量，g。

1.2.7 儲藏穩定性跟蹤 所有β-胡蘿卜素乳液置于25、37、55 ℃和自然光下儲藏28 d，第7、14和28 d測定乳液的透光率和色價。

1.2.8β-胡蘿卜素飲料制備 酸性和中性飲料中添加0.05%β-胡蘿卜素乳液。飲料置于自然光下儲藏60 d，利用色差儀測定飲料顏色，測定指標為L*、a*和b*，并以b*為指標篩選合適的抗氧化劑濃度。

1.2.9 動力學模型構建 對不同維生素E含量的β-胡蘿卜素乳液應用于酸性和中性飲料后儲藏期間的b*進行零級和一級動力學模型擬合，擬合公式如（3）和（4）所示：

1.3 數據處理

每個樣品進行3次重復測定，實驗結果以平均值±標準偏差表示；所有數據用Origin 9.0軟件繪圖；采用SPSS軟件進行單因素ANOVA分析處理，當P＜0.05時被認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 抗氧化劑的選擇

研究表明，引起β-胡蘿卜素氧化降解的因素主要有自動氧化、熱氧化、光氧化、單線態氧和金屬離子催化的氧化、酸降解以及由自由基引發的氧化反應[12]。添加抗氧化劑后可以通過清除自由基、氧氣、螯合金屬離子等方式抑制氧化過程[13]。前期選擇維生素C、維生素E、EDTA-2Na、迷迭香提取物和酶處理異槲皮苷提取物作為抗氧化劑添加至酸性和中性β-胡蘿卜素飲料中。以不添加抗氧化劑的β-胡蘿卜素飲料為空白進行對照。圖1為添加不同抗氧化劑的中性和酸性β-胡蘿卜素飲料在儲藏期間b*的變化。

圖1 β-胡蘿卜素中性（a）和酸性（b）飲料光照儲藏28 d期間b*的變化Fig.1 Change of b* of β-carotene neutral （a） and acid （b）beverages during storage under light for 28 days

由圖1a可知，中性空白β-胡蘿卜素飲料在儲藏14 d后，β-胡蘿卜素降解，飲料顏色完全褪去。添加維生素C后，中性β-胡蘿卜素飲料b*在儲藏期間逐漸降低，但穩定性明顯優于空白飲料。添加維生素E、EDTA-2Na、迷迭香提取物和酶處理異槲皮苷的中性飲料在儲藏期間基本保持顏色穩定。由圖1b可知，酸性空白β-胡蘿卜素飲料在儲藏期間b*逐漸降低，28 d后顏色未完全褪去。添加酶處理異槲皮苷的酸性飲料在儲藏期間b*逐漸降低，后期穩定性優于空白飲料。添加維生素C、維生素E、EDTA-2Na和迷迭香提取物的酸性飲料在儲藏期間基本保持顏色穩定。根據上述結果發現，維生素E、EDTA-2Na和迷迭香提取物對β-胡蘿卜素飲料均有較好的保護作用。后續研究以維生素E作為抗氧化劑為例，探究了不同含量維生素E對β-胡蘿卜素乳液性質、儲藏穩定性和應用穩定性的影響。

2.2 乳液初始表征

2.2.1 粒徑和外觀 納米乳液的分散相質點非常小，加到水中后澄清透明，更適合添加到食品工業中要求外觀澄清透明的飲料中[14]。β-胡蘿卜素乳液的粒徑分布、外觀和飲料外觀如圖2所示。添加不同含量的維生素E對β-胡蘿卜素乳液的粒徑分布有輕微影響。所有β-胡蘿卜素乳液均呈現雙峰分布。未添加維生素E的空白β-胡蘿卜素乳液第一個峰在20 nm左右，此峰可能為連續相中聚集體的粒徑分布，第二個峰在130 nm左右，為乳化油滴的粒徑分布[15]。隨著維生素E含量的增加，β-胡蘿卜素乳液的粒徑分布有輕微右移的趨勢。當維生素E含量為4%時，第二個峰右移至160 nm左右。液滴尺寸取決于油相粘度、油相成分的分子量等多種因素，粒徑的變化可能是因為維生素E的添加改變了油相組成。Sharif等[16]也發現維生素E的加入（2%～4%）可能會導致粘度和粒徑的增大。

圖2 添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液的粒徑和外觀Fig.2 Particle size and appearance of β-carotene emulsion with different content of vitamin E

在外觀上，所有β-胡蘿卜素乳液均呈現深橙色，這與Qian等[2]制備的乳液外觀非常相似。將β-胡蘿卜素乳液以0.05%添加量應用于酸性和中性飲料后，外觀澄清透明（圖中為酸性飲料示例），表明本研究制備的β-胡蘿卜素乳液可以應用于要求有一定色澤且澄清透明的飲料中。

2.2.2 透光率 乳液屬于多分散體系，由許多小液滴組成，當光照射到乳液表面時，會發生反射、散射和透過等現象。在食品工業中，乳液的濁度值非常重要，因為乳液在某些食品基質中的使用取決于其濁度值的大小，透光率越大，給飲料帶來的濁度越小[17]。圖3為添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液的透光率。未添加維生素E的空白β-胡蘿卜素乳液透光率約為80%。隨著維生素E的加入，β-胡蘿卜素乳液透光率有輕微下降趨勢，這與乳液粒徑的變化結果相似，可能是因為當油相含量固定時，乳液粒徑是影響濁度的主要因素，從而導致透光率的變化[18]。

圖3 添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液的透光率Fig.3 Transmittance of β-carotene emulsions with different content of vitamin E

2.2.3 包埋率和色價 圖4為不同維生素E含量對β-胡蘿卜素包埋率的影響，有研究表明，乳液中β-胡蘿卜素的包埋率可能會影響其儲藏穩定性[19]。據文獻[20]報道，吐溫和磷脂兩者復配通常會顯示出較高的包埋率。由圖4可知，未添加維生素E的空白乳液中β-胡蘿卜素的包埋率為90.40%，表明本研究制備的乳液對β-胡蘿卜素有較好的保護作用。而且，維生素E的加入，對β-胡蘿卜素的包埋率沒有顯著影響（P＞0.05）。這與劉蕾[19]發現添加不同含量的EGCG對β-胡蘿卜素的包埋率沒有顯著影響的結果相似。

圖4 添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液的包埋率和色價Fig.4 Encapsulation efficiency and color value of β-carotene emulsions with different content of vitamin E

色價是商業上色素濃度的一種評價方式。由圖4可知，未添加維生素E的空白β-胡蘿卜素乳液色價約為2300。同時，維生素E含量對β-胡蘿卜素乳液的色價沒有影響。

2.3 乳液儲藏穩定性

2.3.1 透光率 圖5為添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液在25、37、55 ℃和光照條件下透光率的變化。由圖5可知，在25、37 ℃和光照條件下儲藏28 d期間乳液透光率基本保持穩定。吐溫是一種小分子乳化劑，分子結構緊密，在均質過程形成乳液時能迅速分散在油水界面降低乳液表面張力，形成較小的乳滴，從而保證了儲藏過程中乳液的穩定[21]。在55 ℃儲藏條件下，所有β-胡蘿卜素乳液儲藏至14 d后透光率均出現下降趨勢。可能原因是高溫加速了分子的熱運動，使乳液微粒聚集，從而粒徑增大，透光率下降[22-23]。同時Zahi等[22]也提出乳液儲藏在較高溫度下，液滴碰撞的機會更多，從而導致更高的濁度值。

圖5 添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液在25 ℃（a）、37 ℃（b）、55 ℃（c）和光照（d）條件下透光率的變化Fig.5 Changes of light transmittance of β-carotene emulsion with different content of vitamin E under 25 ℃ (a),37 ℃ (b), 55 ℃ (c) and light (d)

2.3.2 色價 圖6為添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液在25、37、55 ℃和光照條件下色價的變化。由于不飽和雙鍵的存在，β-胡蘿卜素在儲藏過程中容易發生氧化降解，而儲藏溫度和光照等條件可能會對β-胡蘿卜素乳液的穩定性產生較大影響[24]。由圖6可知，未添加維生素E的空白β-胡蘿卜素乳液，在25 ℃和光照條件下儲藏28 d后色價分別為2220和2332。在37和55 ℃條件下儲藏過程中色價分別降低至1813和1109。結果表明，較高的儲藏溫度會明顯影響β-胡蘿卜素的穩定性。

圖6 添加不同含量維生素E的β-胡蘿卜素乳液在25 ℃（a）、37 ℃（b）、55 ℃（c）和光照（d）條件下色價的變化Fig.6 Changes of color value of β-carotene emulsion with different content of vitamin E under 25 ℃ (a),37 ℃ (b), 55 ℃ (c) and light (d)

維生素E的加入使β-胡蘿卜素乳液在37和55 ℃儲藏28 d后，色價分別提高至2100和1600左右，說明維生素E的加入可以有效提高β-胡蘿卜素的穩定性。這與Tahir Mehmood等[17]發現維生素E的加入顯著提高了β-胡蘿卜素的保留率的研究結果相似，可能原因是維生素E可以清除自由基。劉蕾[19]也發現乳液中添加抗氧化劑可以清除自由基以減緩β-胡蘿卜素的降解。而維生素E的含量對28 d儲藏期間色價穩定性沒有明顯影響。

2.4 應用穩定性

綜合以上結果發現，維生素E的添加提高了乳液儲藏期間β-胡蘿卜素的保留率，后續觀察不同維生素E含量對β-胡蘿卜素在飲料中穩定性的影響。圖7為β-胡蘿卜素乳液應用在中性和酸性體系后在光照條件下儲藏60 d期間b*的變化。b*可以反映飲料的黃色程度[25]。前期進行抗氧化劑選擇時已經發現，中性空白β-胡蘿卜素飲料首先出現明顯的褪色現象，儲藏至14 d后黃色完全褪去。維生素E加入后，中性飲料的b*在儲藏14 d內均未出現明顯的下降現象，表明維生素E的加入提高了中性飲料體系中β-胡蘿卜素的穩定性。酸性空白β-胡蘿卜素飲料儲藏14 d后，b*開始下降，42 d后黃色完全褪去。維生素E加入后，28 d內未發現明顯下降現象。酸性體系中β-胡蘿卜素的穩定性優于中性體系，表明制備的β-胡蘿卜素乳液更適合應用于酸性體系中。儲藏60 d后發現，維生素E含量為3%時，對飲料中β-胡蘿卜素的保護作用最好。

圖7 β-胡蘿卜素中性（a）和酸性（b）飲料光照儲藏60 d期間b*的變化Fig.7 Change of b* of β-carotene neutral （a） and acid （b）beverages during storage for 60 days of light

表1和表2為酸性和中性飲料在儲藏期間β-胡蘿卜素的動力學模型。通過對β-胡蘿卜素飲料的b*進行動力學模型分析發現，零級反應動力學的回歸系數R2均高于一級反應動力學，表明在酸性和中性飲料中β-胡蘿卜素的b*變化均比較符合零級反應[26]。Mesenier等[27]也發現β-胡蘿卜素飲料中添加維生素C和迷迭香提取物后，在40 ℃條件下b*的變化符合零級反應。維生素E的加入減緩了酸性和中性飲料中胡蘿卜素的降解率，且維生素E含量為3%時降解率低，表明該維生素E含量對酸性和中性飲料中的β-胡蘿卜素的保護作用最好。維生素E等抗氧化劑發揮抗氧化或促氧化作用會受到其濃度的影響，在低濃度條件作用下呈現抗氧化趨勢，而在高濃度條件下則表現為促氧化的現象。研究發現在高濃度維生素E條件下，隨著時間發展自由基會不斷積累，從而誘導產生烷基自由基和過氧化自由基，發生促氧化作用[28]。

表1 酸性飲料中的β-胡蘿卜素的動力學模型Table 1 Dynamic model of β-carotene in acidic beverages

表2 中性飲料中的β-胡蘿卜素的動力學模型Table 2 Dynamic model of β-carotene in neutral beverages

3 結論

本研究制備了包埋率高的β-胡蘿卜素納米乳液，探究了不同維生素E含量對乳液粒徑、透光率、包埋率和色價的影響，不同條件下的儲藏穩定性及酸性和中性飲料中的應用穩定性。β-胡蘿卜素乳液的包埋率大于90%，色價約為2300。維生素E的加入對納米乳液粒徑和透光率有輕微影響，但對包埋率和色價沒有明顯影響。在55 ℃條件下，所有β-胡蘿卜素乳液儲藏至14 d后透光率出現下降趨勢，其他條件下基本穩定。37和55 ℃儲藏期間，β-胡蘿卜素乳液的色價逐漸下降，維生素E的加入改善了其色價穩定性。β-胡蘿卜素乳液添加量為0.05%時，飲料外觀澄清透明，在酸性飲料中的穩定性優于中性飲料，3%的維生素E添加量對飲料中β-胡蘿卜素保護作用最佳。