渥堆過程六堡茶品質成分分析及茶褐素抗氧化功能研究

杜金杰，吳新惠，代雨晴，劉曉純，廖楷濱，覃玉娜，鐘麗華，張靈枝

（華南農業大學園藝學院，廣東廣州 510642）

六堡茶作為廣西歷史名茶，國家地理標志性農產品，素有“紅、濃、陳、醇”之稱[1]。其品質形成與渥堆過程微生物作用密切相關[2]。目前，與普洱茶、茯磚茶等其他黑茶相比，六堡茶的研究還相對薄弱。前人對于六堡茶渥堆過程的化學成分分析的研究已經有報道[3]，但針對渥堆過程六堡茶感官品質與化學成分相關聯的研究分析報道仍較少。

近年來，隨著六堡茶產業的飛速發展，六堡茶對人體健康功效的研究報道不斷，加深了人們對六堡茶保健功效的進一步認知。如降脂減肥[4]、祛濕[5]、改善腸道菌群[6]，提高免疫力[7]等。茶褐素是黑茶中含量最高的一種色素類物質，其具有降血糖、降血脂[8-9]、促進膽固醇降解[10]、抑菌[11]、改善腸道菌群[12]、抗氧化[13]、抗癌[14]等一系列特殊功效。采用黃意歡的系統分析法測定數據時，六堡茶茶褐素含量為19.31%～38.61%[15-16]，普洱茶為 7.32%～12.76%[17]，雅安藏茶為3.20%～14.86%[18]。與其他黑茶相比，六堡茶茶褐素相對含量最高。目前國內外對茶褐素的研究主要聚集在三個方面：一是發酵過程茶褐素的形成機理研究；二是茶褐素的提取分離與純化工藝研究；三是茶褐素的生理活性功能研究[19]。成品六堡茶茶褐素提取工藝和抗氧化活性已有研究報道[13]，但針對不同渥堆時間六堡茶茶褐素的化學組分分析和清除DPPH自由基能力的研究仍未有報道。

本試驗以廣西梧州市蒼梧縣群體種毛茶為原料，利用現代化冷水渥堆工藝制作的、不同發酵階段的茶樣為研究對象，進行感官品質和化學成分分析。對不同發酵階段六堡茶茶褐素提取物進行理化成分分析和抗氧化活性比較，旨在探究渥堆過程六堡茶品質特征與化學成分變化規律，以及茶褐素的形成規律和功能活性變化規律，為改進六堡茶加工工藝提供一定參考價值。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

茶樣 為廣西梧州中茶茶廠2020年冷水渥堆現代化生產工藝生產，選取了四個發酵階段進行取樣，分別為：第一階段（0 d毛茶）、第二階段（20 d茶樣）、第三階段（40 d 茶樣）、第四階段（60 d 茶樣）；蒽酮、苯駢戊三酮 天津市科密歐化學試劑有限公司；色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國旭日公司；氯化亞錫 天津化學試劑有限公司；無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯 天津市富宇精細化工有限公司；濃硫酸、無水葡萄糖、鹽酸、結晶氯化鋁、十二水合磷酸氫二鈉 均為國產分析純，廣州化學試劑廠；L-谷氨酸、咖啡堿、牛血清蛋白、沒食子酸（＞99%） 上海綠源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（＞97%） 日本TCI化成工業發展有限公司；福林酚食品純；甲醇 色譜純。

WFJ7200型可見分光光度儀 尤尼柯上海儀器有限公司；FC-14C型差速離心機 廣州方統生物科技有限公司；ALANCEE295高效液相色譜儀 美國WATERS；WD850B型微波爐 格蘭仕中央空調有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣 每個階段取樣均采用五點取樣法，從茶堆的表面和中層分別取等量茶樣，充分混勻。固樣方式參考曾貞等[20]微波固樣方式并稍作修改。微波爐額定輸出功率850 W，額定微波頻率2450 MHz。先100%火力固樣3 min，攤晾降溫至室溫再20%火力微波固樣8 min。取出放置烘箱100 ℃烘干2 h至全干，然后用植物粉碎機粉碎成茶粉，過40目篩后用于檢測理化指標和提取茶褐素。

1.2.2 感官審評 按照GB/T 23776-2018《茶葉感官審評方法》中的黑茶（散茶）的審評方法，由2男3女，具有中（4人）、高級（1人）評茶員職業資格證書的審評老師進行審評，用專業的茶葉審評術語得出審評結果。

1.2.3 茶葉理化成分測定 水浸出物測定參照GB/T 8305-2013；游離氨基酸含量測定參照GB/T 8314-2013；茶多酚含量測定參照GB/T 8313-2018；黃酮類化合物含量測定采用三氯化鋁比色法；可溶性糖含量測定采用蒽酮-硫酸比色法；茶色素含量測定采用系統分析法[21]；咖啡堿含量測定參照GB/T 8312-2013，色譜柱：250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相A：30% 甲醇水溶液；流動相 B：超純水；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

1.2.4 茶褐素提取 茶褐素提取參照周婷等[22]的實驗方法。按照茶水比1:37，稱量20 g干茶粉，加入740 mL 蒸餾水，室溫，100 KHz，超聲 30 min 后 96 ℃水浴浸提86 min，趁熱抽濾后將濾液降壓濃縮至1/5～1/10。依次用等體積氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2次，最后收集水層，按照1:4比例加入無水乙醇，低溫靜置12 h后，9000 r/min離心10 min收集沉淀，再利用真空冷凍干燥機干燥成粉末即為茶褐素，4 ℃下保存。

1.2.5 茶褐素理化成分測定 茶褐素理化成分測定參考田燕華實驗方法[23]；茶褐素總糖含量測定采用蒽酮-硫酸法；總蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法；總酚含量測定采用福林酚法；茶褐素溶液pH測定采用pH計直接測定。

1.2.6 茶褐素清除DPPH自由基能力 實驗方法參考田燕華[23]實驗方法。陽性對照組：配制濃度為0.1 mg/mL的VC母液。將母液稀釋成濃度分別為5、7.5、10、12.5、15、20 μg/mL 的稀釋液。試管中加入不同濃度VC稀釋液和1 mmol/L DPPH溶液各2 mL，空白對照組加入等量超純水，搖勻，避光反應30 min，517 nm波長下測量吸光值。茶褐素組：配制濃度為0.2 mg/mL的茶褐素母液，將母液稀釋成濃度分別為10、20、30、40、50、60 μg/mL 的稀釋液。試管中加入不同濃度茶褐素稀釋液和1 mmol/L DPPH溶液各2 mL，空白對照組加入等量超純水，搖勻，避光反應30 min，517 nm波長下測量吸光值。

DPPH自由基清除率（%）=[（對照組吸光值-樣品組吸光值）/對照組吸光值]×100

以樣品濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，繪制清除曲線。以清除曲線計算清除率為50%時的樣品濃度為評價指標（即自由基半數抑制濃度IC50）。

1.3 數據處理

測定結果取3次重復試驗的平均值。采用Excel 2016進行數據處理，采用SPSS 24進行方差分析和顯著性分析，采用GraphPadPrism8進行作圖。采用Photoshop進行圖片拼接。

2 結果與分析

2.1 渥堆過程六堡茶感官品質特征

實驗對渥堆過程六堡茶的外形、香氣、滋味、湯色、葉底進行審評。其干茶外形，湯色底的外觀圖如圖1所示，品質評價結果如表1所示。在外觀方面：隨著發酵時間的延長，干茶的色澤、茶湯湯色、葉底的色澤都由淺至深發生顯著的變化。發酵60 d的茶湯湯色，已經初步具備了六堡茶“紅、濃”的要點。在品質評價方面：0 d的毛茶，其香氣高揚，持久，具有日曬氣，滋味醇厚，有刺激性，回甘。而發酵了20 d的六堡茶，湯色滋味變化仍不顯著。發酵了40 d的六堡茶，其湯色由深黃轉變為橙黃，葉底明顯更柔軟，推測微生物一些胞外酶，如纖維素酶，果膠酶將茶葉細胞分解，導致葉底變得柔軟[24]。其次，發酵40 d的六堡茶，其滋味發酸，而且香氣粗雜，帶有酸餿味。推測應該是發酵過程香氣物質發生轉化，形成了一些不好聞的過渡型香氣物質[25]，至于為何會呈現酸餿味，以及40～60 d的發酵過程中，40 d時的酸餿味是如何轉化成為60 d時濃郁的花果香，仍待進一步分析。發酵60 d的六堡茶，已經具備一個商品茶“紅、濃、陳、醇”的品質特征。其湯色紅棕，滋味由苦澀，有刺激性轉變為了醇厚、順滑，且湯中帶有一絲糯香。香氣純正，果香濃郁。

圖1 渥堆過程六堡茶品質外觀圖Fig.1 Quality appearance of Liupao tea during fermentation process

表1 渥堆過程六堡茶感官品質審評結果Table 1 Sensory quality evaluation of Liupao tea during fermentation process

綜上分析，在使用優質六堡茶原料的前提基礎上，冷水渥堆現代工藝發酵初期物質轉換速度不明顯，但到發酵第四階段（60 d），其茶樣湯色、香氣、滋味均基本達到六堡茶“紅、濃、陳、醇”的品質特征。

2.2 渥堆過程六堡茶主要成分變化

渥堆過程六堡茶主要內含成分變化見表2。由表2可知，隨著渥堆時間的延長，茶葉中的水浸出物、茶多酚、茶紅素、游離氨基酸，黃酮類物質含量都呈現顯著下降趨勢（P＜0.05），其結論與張芬等[26]的研究結果一致。與0 d（毛茶）相比，發酵60 d的六堡茶的水浸出物、茶多酚、茶紅素、游離氨基酸、黃酮含量分別減少了 34.11%（P＜0.05）、65.22%（P＜0.05）、77.56%（P＜0.05）、87.67%（P＜0.05）、16.49%（P＜0.05）。茶黃素和可溶性糖含量沒有明顯變化規律，前者含量在0.16%～0.28%之間波動，后者含量在1.11%～1.16%之間波動變化。茶褐素含量明顯增加，與0 d（毛茶）相比，發酵60 d的六堡茶茶褐素含量增加了2.28倍?？Х葔A含量總體呈現增加趨勢，但不顯著（P＞0.05），其含量從0 d的3.28%增加到了60 d時的3.98%。檢測結果中，六堡毛茶的游離氨基酸含量非常高，達到了6.96%，目前已知的高氨基酸茶樹品種有凌云11號、凌云6號、短節白毫等，其游離氨基酸含量為8%左右[27]，游離氨基酸是使茶葉呈現鮮爽感官品質的主要內含物。單從茶葉深加工的方向考慮，此種質資源有專項開發的潛質。

表2 渥堆過程六堡茶理化成分變化Table 2 Variation of main physical and chemical components of Liupao tea during fermentation process

2.3 不同渥堆時期六堡茶茶褐素理化成分分析

不同渥堆階段六堡茶茶褐素溶液pH結果如表3所示。由表3可知，茶褐素溶液濃度為0.2 μg/mL時，其pH為6.60～6.74之間，說明茶褐素為一種弱酸性的物質。不同渥堆階段的茶褐素溶液pH之間沒有顯著性差異（P＞0.05）,其結論與吳恩凱等[16]、田燕華[21]的研究結果一致。不同渥堆階段六堡茶茶褐素提取物的主要化學組分結果如表4所示。由表4可知，不同渥堆階段六堡茶茶褐素蛋白質含量整體呈現增加的趨勢。20與40 d的茶褐素相比,茶褐素的蛋白質含量有所增加，但不顯著（P＞0.05）。40與60 d的茶褐素相比，茶褐素的蛋白質含量顯著增加（P＜0.05），由40 d時的11.39%增加至60 d時的14.97%；不同渥堆階段六堡茶茶褐素的總酚含量呈現顯著增加趨勢（P＜0.05），由20 d時候的9.01%增加至60 d的17.07%，增加了1.89倍。總糖含量也從20 d的11.78%顯著增加（P＜0.05）至60 d的17.25%。茶褐素含量的增加，在于渥堆過程中微生物通過分泌胞外酶，促進多酚類物質氧化、聚縮合，形成大分子物質[28]。同時，這些生物活性酶通過分解茶葉細胞和組織，從而增加了與茶褐素絡合的蛋白質、游離多糖、黃酮等酚類物質[29]。推測是導致茶褐素提取物的總糖、總蛋白、總酚含量顯著增加的主要原因。

表3 渥堆過程不同六堡茶茶褐素溶液的pHTable 3 pH of different theabrownins solution that extracted from Liupao tea during fermentation process

表4 渥堆過程不同六堡茶茶褐素主要化學成分Table 4 Main components of different theabrownins that extracted from Liupao tea during fermentation process

2.4 不同渥堆階段六堡茶茶褐素清除DPPH自由基能力比較

DPPH是目前體外模型測定樣品清除自由基能力最常用的方法之一[30]。為評價不同抗氧劑之間清除自由基的能力，以自由基半數抑制濃度IC50作為評價指標，IC50值越小，代表其抗氧化能力越強。

由圖2可知，茶褐素濃度在 10～60 μg/mL時，對DPPH自由基清除率呈現劑量依賴性，隨著濃度增加，清除率增加，但是低于陽藥組（VC）。由表5可知，40和60 d的茶褐素溶液清除DPPH自由基能力要強于20 d的茶褐素溶液，但40與60 d的茶褐素溶液之間的IC50差異不明顯，兩者清除自由基能力相當?？偟膩碚f，各茶褐素提取物濃度為IC50時，其抗氧化能力為：VC＞40 d＞60 d＞20 d。眾所周知，多酚類物質具有顯著的抗氧化功能[31-32]，不同六堡茶茶褐素的化學組分分析結果也表明，隨著渥堆天數的增加，總酚的含量顯著增加（P＜0.05），這與其對應的抗氧化能力有一定相關性。40與60 d的茶褐素相比，其總酚含量顯著增加（P＜0.05），但是清除自由基能力卻差異不大，推測茶褐素分子結構中的結合酚清除自由基的原理與游離酚有所不同[32]。同時，茶褐素清除DPPH自由基的能力與該茶褐素的空間構象，電子轉移能力也有一定關系[33]。在本實驗中，濃度為0.2 μg/mL時，40 d的茶褐素溶液的pH比60 d同樣濃度的茶褐素溶液濃度略低，推測40 d的茶褐素溶液的電子轉移能力比60 d的茶褐素溶液相對更強，所以其IC50值相對更小，抗氧化能力更強。

圖2 渥堆過程六堡茶茶褐素清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH free radical scavenging activity of theabrownins of Liupao tea during fermentation process

表5 渥堆過程六堡茶茶褐素IC50值比較Table 5 Comparison of IC50 values of theabrownins of Liupao tea during fermentation process

3 結論與討論

試驗結果表明，發酵60 d的茶樣從干茶、湯色、滋味、葉底來看，已經基本具備商品茶“紅、濃、陳、醇”的品質特征。渥堆過程水浸出物、茶多酚、茶紅素、游離氨基酸、黃酮類物質等含量都顯著下降（P＜0.05），茶褐素含量顯著增加（P＜0.05）。茶湯滋味由濃強、刺激轉變為醇和、順滑。后發酵黑茶化學成分的變化受多因素影響，微生物生化作用和濕熱作用是主要影響原因。隨著人們對多元化的追求，風味化、功能化的定向發酵是六堡茶乃至整個黑茶產業未來發展的重要方向，因此進一步深入研究微生物生化作用和濕熱作用對六堡茶渥堆過程化學成分的影響機理，具有重要意義。

茶褐素的理化結果分析和清除自由基能力表明，隨著渥堆天數增加，茶褐素中的總糖、總蛋白、總酚含量都是增加的趨勢。在各茶褐素提取物自由基半數抑制濃度（IC50）時,其清除DPPH自由基的能力為：VC組＞40 d＞60 d＞20 d。發酵 40與 60 d的茶褐素清除DPPH自由基的能力差異不明顯，但相對20 d的茶褐素均明顯增強，證明渥堆發酵能夠提升六堡茶茶褐素提取物清除DPPH自由基的能力，是六堡茶加工工藝的重要工藝。

目前，學術界對于茶褐素的定義有兩種，一部分學者認為，那些與茶褐素本身絡合在一起的游離多糖、蛋白質、核酸等小分子物質并不是“茶褐素”本身，因此茶褐素的功能仍不能直接斷定為是其茶褐素自身的功能基團起的作用。因此他們一直致力于運用各種分離純化的方法去進一步純化茶褐素，目的就是為了得到高純度的茶褐素組分，但是目前為止，仍未有文章報道分離純化到茶褐素單體。另外一部分學者則認為，既然各種方法都不能完全分離干凈茶褐素中的蛋白質、多糖、游離氨基酸等小分子物質，因此未來可以考慮，在驗證其生物活性時，可以把茶褐素與各小分子物質看成一個整體。在各組分含量達到一定區間范圍時，歸類為同一類茶褐素。此外，茶褐素作為六堡茶的特征性成分，其各種保健功效雖已有大量文獻報道，但其作用機理仍有待進一步探究。