AA野生種花生Ty1-copia類反轉座子RT基因的克隆與序列分析

蔡鐵城 劉俊仙 張沖 劉菁 陽太億 蔣菁 賀梁瓊 韓柱強 唐榮華 莊偉建 熊發前

摘 要：? 該研究旨在克隆Ty1-copia類反轉錄轉座子RT（reverse transcriptase）基因，為分離花生屬Ty1-copia類反轉錄轉座子全長序列和研究其功能提供序列基礎。根據RT基因的保守區設計簡并引物，以兩份AA染色體組野生種花生Arachis duranensis為試材，利用PCR擴增其基因組DNA，回收、克隆和測序目的條帶后，對所獲得序列進行生物信息學分析。結果表明：（1）目的條帶大小約為260 bp，分別從兩份野生種花生材料中克隆到41條和27條RT基因序列，68條序列的長度變化范圍為256 ～270 bp，AT所占比例范圍為55.86%～68.42%，AT與GC比例范圍為1.27～2.17，核苷酸序列間相似性范圍為49.8%～99.2%，存在較高異質性。（2）68條序列被分為6個家族，家族Ⅰ和Ⅳ為主要家庭。（3）68條序列中的19條發生了無義突變，A. duranensis（PI219823）要比A. duranensis（PI262133）的無義突變率高。（4）氨基酸序列間相似性為4.7%～100%，呈現高度異質性。（5）各家族中代表序列的蛋白質三級結構在整體構型上一致，但在螺旋結構數、折疊結構數、轉角數和氫鍵數上存在較大差別。（6）序列間保守基序總體一致，但也存在一定變異，呈現一定異質性;系統進化樹將68條序列分為10類，大部分序列都聚在A和B兩大類中。（7）另有部分AA染色體組野生種花生的RT基因序列與其他物種植物的RT基因序列親緣關系較近，推測不同物種植物間可能發生過Ty1-copia類反轉錄轉座子的橫向傳遞。該研究為花生屬基于Ty1-copia類反轉錄轉座子的新分子標記開發和應用奠定基礎。

關鍵詞： 花生， Ty1-copia類反轉錄轉座子， 反轉錄酶， 野生種， 異質性

中圖分類號：? Q943

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）01-0100-13

收稿日期：? 2021-07-15

基金項目：? 國家自然科學基金（31960409，32072103，31960416）;廣西自然科學基金（2018GXNSFDA281027，2018GXNSFDA294004，2020GXNSFAA297081）;福建省科技廳農業引導性（重點）項目（2018N0004）;廣西農業科學院科技發展基金（桂農科2018YM06，桂農科2017JZ13，桂農科31960409，桂農科2021YT052）? [Supported by the National Natural Science Foundation of China （31960409， 32072103， 31960416）; Guangxi Natural Science Foundation （2018GXNSFDA281027， 2018GXNSFDA294004， 2020GXNSFAA297081）; Guiding Key Project of Department of Science and Technology of Fujian Province? （2018N0004）; Scientific and Technological Development Foundation of Guangxi Academy of Agricultural Sciences （GNK2018YM06， GNK2017JZ13， GNK31960409， GNK2021YT052]。

第一作者： 蔡鐵城（1983-），碩士，助理研究員，主要從事花生遺傳育種和分子生物學研究，（E-mail）caitiecheng1027@163.com。

*通信作者：? 熊發前，博士，研究員，主要從事花生種質資源和遺傳育種及分子生物學研究，（E-mail）xfq2002@126.com。

Cloning and sequence analysis of reverse transcriptase

genes of Ty1-copia-like retrotransposons in wild

peanut species with AA genome

CAI Tiecheng1， LIU Junxian3， ZHANG Chong1， LIU Jing2， YANG Taiyi2，

JIANG Jing2， HE Liangqiong2， HAN Zhuqiang2， TANG Ronghua2，

ZHUANG Weijian1， XIONG Faqian2*

（ 1. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China; 2. Cash

Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China;? 3. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Nanning 530007 ）

Abstract：? The purpose of this study was to clone the reverse transcriptase （RT） genes of Ty1-copia-like retrotransposons， and to provide sequences basis for isolating the full-length sequences of Ty1-copia-like retrotransposons and studying their function in genus Arachis. Degenerate primers were designed according to the conserved region of RT genes， the genomic DNA of wild peanut species Arachis duranensis with AA genome was amplified by PCR using the degenerated primers. The amplified targeted bands were recovered， cloned and sequenced， and then the sequences were analyzed through bioinformatics analysis. The results were as follows： （1） The amplified targeted bands were all about 260 bp in size. Forty-one and twenty-seven RT genes sequences were cloned from the two wild peanut species respectively. The length of sixty-eight sequences varied from 256 to 270 bp.? The proportion of AT， AT/GC and the similarity between nucleotide sequences ranged from 55.86% to 68.42%， 1.27 to 2.17， and 49.8% to 99.2% respectively， showing a higher heterogeneity. （2） The sixty-eight sequences were divided into six families， Family I and Family IV were the main families. （3） Nineteen of sixty-eight sequences had nonsense mutations， and Arachis duranensis （PI219823） had a higher nonsense mutations rate than Arachis duranensis （PI262133）. （4） The similarity between amino acid sequences ranged from 4.7% to 100%， showing a high heterogeneity. （5） The tertiary structures of proteins representing sequences in each family were basically similar in overall configuration， but there were great differences in the number of helix structures， folding structures， turns and hydrogen bonds. （6） The conserved motifs among sequences were generally consistent， but there were also some variations， showing a certain degree of heterogeneity. The phylogenetic tree divided sixty-eight sequences into ten classes. Most of sequences were clustered in A and B classes. （7） Some of RT genes sequences from two wild peanut species with AA genome were closely related to RT genes sequences from other plant species， which indicated that there might be transposon horizontal transmission between them. This study provides? reference for the development and application of new molecular markers based on Ty1-copia-like retrotransposons in genus Arachis.

Key words： peanut， Ty1-copia-like retrotransposons， reverse transcriptase （RT）， wild species， heterogeneity

花生被譽為“長生果”，全世界有106個國家種植。花生是我國主要食用油原料，我國是世界上重要的花生生產國。當前我國選育出的花生品種主要是利用傳統雜交育種，但存在周期長、效率低、目的性不強等缺點，而分子育種可以加速育種進程，但是缺少簡單實用高效的DNA分子標記。在花生上，傳統分子標記技術想檢測出豐富多態性十分困難（熊發前等，2010;王強等，2010;Xiong et al.， 2011），雖然近幾年在花生上也有利用SNP標記進行關聯及連鎖分析的研究報道（Zhang et al.， 2017;Han et al.， 2018;Wang et al.， 2018），但當前在花生上使用最廣泛的是SSR標記，然而能在任意兩個栽培種花生品種間檢測出DNA多態性的SSR標記引物對還比較匱乏（熊發前等，2010;Xiong et al.， 2011）。

LTR反轉錄轉座子主要包括Ty1-copia和Ty3-gypsy兩大類（Kumar & Bennetzen， 1999;Feschotte et al.， 2002;Bonchev & Parisod， 2013），這兩類LTR反轉錄轉座子中的RT基因序列都可以通過簡并PCR技術擴增克隆（Voytas et al.， 1992;Kumekawa et al.， 1999）。LTR反轉錄轉座子的普遍性、高拷貝、高度異質性和插入位點多態性等特性使其非常適合開發分子標記。

但到目前為止，在花生上尚未見到基于LTR反轉錄轉座子開發分子標記的研究報道。而分離和鑒定LTR反轉錄轉座子是分子標記開發利用的前提。花生LTR反轉錄轉座子的研究報道較少，Nielen等（2010， 2012）先后分離出花生Ty3-gypsy類反轉錄轉座子的FIDEL和Ty1-copia類反轉錄轉座子的Matita，對FIDEL和Matita的特性和作用進行了分析。筆者曾系統對花生LTR反轉錄轉座子和MITE轉座子的分離及其應用的國內外研究現狀及進展進行了歸納（熊發前等，2017）。

本研究擬從兩份AA染色體組野生種花生材料Arachis duranensis中克隆Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因，分析其序列特征和多樣性，為分離花生屬Ty1-copia類反轉錄轉座子全長序列和研究其功能提供序列基礎，為花生屬基于Ty1-copia類反轉錄轉座子的新分子標記開發和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在廣西農業科學院武鳴里建科研基地的花生野生圃里隨機摘取兩份AA染色體組野生種花生材料Arachis duranensis（PI262133）和Arachis duranensis（PI219823）各5株健康植株的頂端芯葉進行混合。

1.2 基因組DNA的提取

花生高質量基因組DNA的提取采用改良CTAB法（熊發前等，2019）。

1.3 RT基因的PCR擴增

上游引物為RTp1：5′-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3′，下游引物為RTp2：5′-ARCATRTCRTCNACRTA-3′，其中，R=A/G，Y=C/T，N=A/T/C/G（Kumar et al.，1997）。PCR擴增體系和擴增程序以及PCR產物的分離檢測參考熊發前等（2019）的方法。

1.4 PCR產物的回收、克隆及測序

參考陽太億等（2019）的方法進行。

1.5 RT基因的序列分析

序列相似性檢索、序列統計分析、序列圖及Logo圖的生成、蛋白二級結構與三級結構預測、蛋白三級結構的轉角數和氫鍵數統計、保守基序預測等參考陽太億等（2019）進行。運用MEGA 6.0軟件的鄰接法（No. of differences模型）構建系統進化樹，自展值設置為1 000，所用其他物種的Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因序列信息見表1。

2 結果與分析

2.1 RT基因的PCR擴增及測序

對AA染色體組野生種花生材料A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）的基因組DNA進行PCR擴增， 結果顯示，在2份花生材料中都擴增出了大小約260 bp的特異條帶（圖1）。將目的條帶進行回收、克隆和測序，從A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）中分別獲得了42條和38條序列。利用DNAMAN軟件去除相同序列，利用NCBI數據庫對序列進行同源性分析進而去除非目標序列，最后從A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）中分別獲得了41條和27條目標序列，并分別命名為AdRT1-X和AdRT2-X（表2）。對這些RT基因序列進行多重比對（圖2），利用weblogo生成了序列logo圖以展示每個位置上堿基的保守性（圖3）。

2.2 RT基因序列分析

利用BioEdit軟件對RT基因序列進行統計分析，結果見表2，從中可以看出，所有序列長度都在256 ～270 bp之間，存在缺失或插入突變。在A. duranensis（PI262133）的41條序列中，AdRT1-47的序列長度最短，為256 bp，AdRT1-11的序列長度最長，為267 bp，長度為266 bp的序列占總序列數的90.24%;A、T、C、G數量變化范圍分別為65～88、78～94、29～61和49～67，AT所占比例范圍為55.86%～68.42%，AT與GC比例為1.27～2.17;核苷酸序列間相似性范圍為50%～99.2%，其中，AdRT1-26與AdRT1-25之間的相似性最高，達99.2%，AdRT1-47與AdRT1-7以及AdRT1-47與AdRT1-29之間的相似性最低，均為50%，氨基酸序列間相似性范圍為4.7%～100%。在A. duranensis（PI219823）的27條序列中，AdRT2-24的序列長度最短，為257 bp，AdRT2-7的序列長度最長，為270 bp，長度為266 bp的序列占總序列數的74.07%;A、T、C、G數量變化范圍分別為62～93、71～93、32～56和66～68，AT所占比例范圍為57.20%～67.29%，AT與GC比例為1.34～2.06;核苷酸序列間相似性范圍為49.8%～99.2%，其中，AdRT2-3與AdRT2-4之間的相似性最高，達99.2%，AdRT2-13與AdRT2-27之間的相似性最低，為49.8%，氨基酸序列間相似性范圍為14.6%～100%。

2.3 RT基因核苷酸序列聚類分析

利用MEGA 6.0軟件對RT基因序列進行聚類分析（圖4）。遺傳進化樹顯示，68條序列被劃分為6個家族，家族Ⅰ包含28條序列，其中，18條來自A. duranensis（PI262133），10條來自A. duranensis（PI219823），所含序列數占總序列數的41.18%;家族Ⅱ包含9條序列;家族Ⅲ只包含AdRT1-29，該序列與家族Ⅰ親緣關系較遠而單獨聚為一類，造成該序列單獨為一類的原因可能是堿基替換;家族Ⅳ包含23條序列，其中，有17條來自A. duranensis（PI262133），6條來自A. duranensis（PI219823），所含序列數占總序列數的33.82%;家族Ⅴ包含3條序列;家族Ⅵ包含4條序列。家族Ⅴ和家族Ⅵ與另外4個家族遺傳距離較大，親緣關系較遠，因為這兩個家族中的序列存在堿基缺失的現象。

2.4 RT基因氨基酸序列分析

利用MEGA 6.0軟件對RT基因氨基酸序列進行分析（圖5）。結果顯示，68條序列中有19條發生無義突變，其中，9條序列來自A. duranensis（PI262133），占該材料序列總數的21.95%，10條序列來自A. duranensis（PI219823），占該材料序列總數的37.04%，就無義突變發生率來說，A. duranensis（PI219823）要比A. duranensis（PI262133）高。無義突變在2份花生材料中的具體表現如下：AdRT2-21發生了8個無義突變，分別在第31、第34、第65、第66、第71、第75、第76和第77個氨基酸處;AdRT2-5發生了7個無義突變，分別在第51、第58、第74、第75、第76、第77和第87個氨基酸處;AdRT1-47發生了6個無義突變，分別在第18、第26、第30、第37、第79和82個氨基酸處;AdRT1-11發生了5個無義突變，分別在第41、第71、第75、第76和第77個氨基酸處;AdRT1-16發生了5個無義突變，分別在第54、第58、第80、第81和第84個氨基酸處;AdRT2-10發生了5個無義突變，分別在第54、第58、第81、第82和第84個氨基酸處;AdRT1-4發生了2個無義突變（分別在第26和第41個氨基酸處）;AdRT1-23發生了2個無義突變（分別在第8和第39個氨基酸處）;AdRT1-7、AdRT1-22、AdRT1-34、AdRT1-48、AdRT2-7、AdRT2-11、AdRT2-27、AdRT2-37、AdRT2-38

和AdRT2-42都只發生了1個無義突變;部分序列存在連續無義突變的現象，無義突變會影響到反轉錄轉座子的轉錄活性。

2.5 RT基因的蛋白結構預測

將獲得的68條Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因序列統一翻譯成氨基酸后，根據核苷酸聚類結果，分別選擇兩份花生材料中每個家族中的代表序列，利用在線程序Phyre2預測其蛋白質的二級結構和三級結構（表3，圖6，圖7），代表序列蛋白三級結構匹配覆蓋度最高的模板為d1hara、c4rs7R、d1sqwa1、c5xvnM，置信度均為16.5～86.2，其中只有d1hara屬于逆轉錄酶家族，其余蛋白均未匹配到逆轉錄蛋白模板。二級結構包含2～3個α-螺旋和5個β-折疊; 三級結構包含2～6個轉角和9～30個氫鍵，還存在1個明顯的螺旋結構和2個不明顯的折疊結構。

2.6 RT基因保守基序預測

RT基因保守基序預測結果顯示， 68條序列共存在11種保守基序，其中，有57條序列同時包含motif 1、motif 2和motif 3， 占總序列數的83.82%，說明這3種保守基序是AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因的主要保守基序，這也從保守基序角度表明兩個AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因具有非常高的保守性與相似性。AdRT2-27和AdRT2-38同時包含motif 3、motif 4和motif 6，motif 4和motif 6這兩個保守基序在位置上與motif 1和motif 2相同，但氨基酸的排列和組成并不相同;AdRT1-11包含motif 1、motif 3和motif 7;AdRT1-16和AdRT2-10同時包含motif 1和motif 5，在系統進化樹中，這2條序列為同一類;AdRT2-19包含motif 1和motif 10;AdRT2-24包含motif 8、motif 9和motif 10;AdRT2-21包含motif 1和motif 7，這3條序列在系統進化樹中均單獨歸類;AdRT1-47包含motif 8和motif 9;AdRT2-5包含motif 7、motif 8和motif 11;AdRT1-23只包含motif 11，這3條序列在系統進化樹中歸為同一類，其中，motif 8和motif11的長度較短，位于序列上游部分。部分保守基序在所克隆序列中出現的頻率較低且長度較短，說明這些序列在進化過程中發生了突變（圖8）。

2.7 RT基因序列系統進化樹構建

構建系統進化樹（圖9），所有RT基因序列可分為10類，大部分RT基因序列都聚在A和B兩大類中，表明本研究中AA染色體組野生種花生的RT基因序列具有相當高的保守性與相似性。A類包含20條來自A. duranensis（PI262133）的序列和15條來自A. duranensis（PI219823）的序列，這35條序列與來自葡萄（Vitis vinifera，CAN67451.1）、綠豆（Vigna radiata，AAT90460.1、AAT90479.1）、鷹嘴豆（Cicer arietinum，CAD59770.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，CAA13067.1）、西洋參（Panax quinquefolius，ABU94811.1）、野茶樹（Camellia sinensis，CAJ09751.1）、李子（Prunus salicina，AGX45518.1）、蘋果（Malus domestica，ABS11062.1）、煙草（Nicotania tabacum，AAA03507.1）的序列之間具有較高相似性，親緣關系較近。B類包含17條來自A. duranensis（PI262133）的序列和5條來自A. duranensis（PI219823）的序列，說明這22條序列之間具有較高相似性。C類只有AdRT1-29，該序列與來自油菜（Brassica napus，AAA32987.1）、梅花（Prunus mume，ABF57071.1）、大豆（Glycine max，E47759）、藜麥（Chenopodium quinoa，AEX61031.1）、番茄（Lycopersicon esculentum，AAC34611.1）、大狗尾草（Setaria faberi，AAL36472.1）、水稻（Oryza sativa，AAA33902.1）和玉米（Zea mays，AAK84849.1）的序列之間具有較高相似性，親緣關系較近。D類中是來自綠豆、歐洲云杉和石蒜的3條序列，這3條序列與大多數AA染色體組野生種花生和其他物種植物的序列親緣關系較遠。E類只包含2條序列，分別是來自AA染色體組野生種花生的AdRT2-24和擬南芥的S71291，說明這2條序列之間親緣關系最近。F-J類中的3條和7條序列分別來自Arachis duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823），均不包含其他物種植物的序列。

3 討論與結論

本研究用同一簡并引物從同一種野生花生種質中克隆獲得的Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因的核苷酸和氨基酸序列在序列長度、序列組成及序列相似性等方面存在較大差異和多態性，表明同一種野生花生種質內同一類群反轉錄轉座子存在較高異質性。另外，兩份野生種花生材料中RT基因序列均富含AT堿基，富含AT導致呈現較高異質性;RT基因核苷酸序列間相似性呈現較高異質性; 有19條氨基酸序列發生了無義突變， 導致呈現較高異質性;RT基因氨基酸序列間相似性呈現高度異質性;68條RT基因序列間保守基序也呈現一定異質性;家族Ⅴ和家族Ⅵ中的代表序列在螺旋結構、折疊結構、轉角數、氫鍵數上與其他家族代表序列存在較大差別，呈現較高異質性和多態性。總之，兩份野生種花生材料中RT基因序列在AT堿基含量、核苷酸序列間相似性、氨基酸序列間相似性、氨基酸無義突變率、保守基序、蛋白質二級結構及三級結構上均呈現異質性。

家族Ⅰ-Ⅳ中代表序列的蛋白質三級結構在整體構型上基本類似，但在螺旋結構數、折疊結構數、轉角數和氫鍵數上存在較大差別，家族Ⅴ中的AdRT1-16只存在2個明顯的螺旋結構，其轉角數和氫鍵數也明顯少于其他序列;家族Ⅵ中的AdRT1-47的氫鍵數遠遠少于其他序列，其轉角數也少于其他序列，且其螺旋結構較短;AdRT2-27相較于其他序列存在2個明顯的折疊結構和1個不明顯的折疊結構，其轉角數和氫鍵數都少于其他序列，推測這些差別可能會影響到Ty1-copia類反轉錄轉座子的拷貝數、轉錄活性及轉座效率等。

遺傳進化樹顯示，6個家族中的Ⅰ和Ⅳ是主要家族，表明AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因序列具有非常高的保守性與相似性。另外，各家族內部成員越復雜，序列相似性越高，存在有轉錄活性的反轉錄轉座子的可能性也越大，其轉座發生的時間可能越近（Tang et al.， 2005），由此推測，家族Ⅰ和家族Ⅳ很有可能是存在具有轉錄活性的Ty1-copia類反轉錄轉座子的家族，存在的歷史也更為久遠。

系統進化樹顯示，A類中的35條AA染色體組野生種花生RT基因序列與葡萄、綠豆、鷹嘴豆、馬鈴薯、西洋參、野茶樹、李子、蘋果、煙草的序列之間相似性較高;C類中的AdRT1-29與來自油菜、梅花、大豆、藜麥、番茄、大狗尾草、水稻、玉米的序列之間相似性較高;E類中的AdRT2-24與擬南芥的S71291之間的相似性較高，推測AA染色體組野生種花生Ty1-copia類反轉錄轉座子曾可能與這些物種植物間發生過橫向傳遞。F-J類中的RT基因序列均來自AA染色體組野生種花生，且與AA染色體組野生種花生和其他物種植物的RT基因序列遺傳距離最大，親緣關系最遠，表明這幾類中的RT基因序列在起源和進化上可能較為古老，特異性比較強，有可能為A. duranensis（PI262133）和A. duranensis（PI219823）所特有。

總之，本研究從AA染色體組野生種花生中成功克隆到Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因序列，對花生屬基于LTR反轉錄轉座子的分子標記開發及花生分子育種具有重要意義，將為下一步分離其全長序列、研究其轉錄和轉座活性及功能提供序列基礎。

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（責任編輯 李 莉）

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