鐵線蓮屬21個類群的染色體核型分析

李明陽 劉彥澤 王鑫 劉冬云

摘 要：? 鐵線蓮屬（Clematis L.）為毛茛科大屬之一，具有重要的園藝與藥用價值。為探討鐵線蓮屬植物染色體組演化規律，揭示屬下組間及種間的親緣關系，該研究采用常規壓片法對鐵線蓮屬21個類群的根尖進行處理、壓片，對染色體的形態特征進行觀察及核型分析，同時利用Ward聯接法進行聚類分析研究。狹裂太行鐵線蓮、毛果揚子鐵線蓮、卷萼鐵線蓮、中印鐵線蓮、鈍萼鐵線蓮的染色體形態為首次報道。結果表明：鐵線蓮屬21個類群均為二倍體，染色體數均為16（2n=2x=16），除中印鐵線蓮外其他類群均具隨體;長瓣鐵線蓮、鈍萼鐵線蓮、芹葉鐵線蓮、褐毛鐵線蓮、C. flammula、毛果揚子鐵線蓮的染色體為“2B”型，其他類群染色體為 “2A”型;鐵線蓮屬核型不對稱系數在60.29%～63.79%之間;鐵線蓮屬植物染色體組表現的較為原始，種間核型存在廣泛變異。綜上結果表明，鐵線蓮屬植物染色體數目應由二倍體向多倍體演化后通過多倍體的二倍化過程產生非整倍體方向演化。鐵線蓮屬染色體的演化主要在二倍體水平上進行，通過產生染色體結構變異的方式實現，通過產生雜合染色體、加強核型不對稱性、染色體類型改變以及隨體染色體的變化四種途徑進化。同時，核型特征在分組水平與物種水平上的劃分與傳統分類基本一致，說明核型分析可為鐵線蓮屬下組一級分類提供一定的線索。該研究結果為鐵線蓮屬植物系統分類、遺傳演化與資源利用等研究領域提供了新的參考資料。

關鍵詞： 鐵線蓮屬， 染色體， 聚類分析， 核型分析， 細胞學

中圖分類號：? Q949.746.5

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）01-0078-12

收稿日期：? 2021-08-28

基金項目：? 河北省鐵線蓮種質資源收集與新種質創新項目（1220256）;現代林業學科群項目（XK1008601519） [Supported by Collection and Innovation of Clematis Germplasm Resources Project in Hebei Province（1220256）; Modern Forestry Subject Group Project（XK1008601519）]。

第一作者： 李明陽（1996-），碩士研究生，主要從事園林植物遺傳育種研究， （E-mail）1054468775@qq.com。

*通信作者：? 劉冬云，博士，副教授，碩士生導師，主要從事地被植物資源收集及育種研究， （E-mail）dongyunliu@hebau. edu.cn。

Chromosome karyotype analysis of 21 Clematis taxa

LI Mingyang1， LIU Yanze2， WANG Xin1， LIU Dongyun1*

（ 1. College of Landscape and Travel， Hebei Agricultural University， Baoding 071000， Hebei， China; 2. Management

Center of Wuling Mountain National Nature Reserve， Chengde 067300， Hebei， China ）

Abstract：? Clematis L. is one of the major genera of Ranunculaceae， and has important horticultural and medicinal values. In order to discuss the chromosome evolution law of Clematis plants， reveal the genetic relationship among sections and species， karyotype analysis in 21 Clematis taxa were observed. In this study， the root tips of 21 groups of Clematis were treated and pressed by conventional pressing method， the morphological characteristics of chromosomes were observed， karyotype was analyzed， and cluster analysis was carried out by Ward connection method. C. kirilowii var. chanetii， C. puberula var. tenuisepala， C. tubulosa， C. tibetana and C. peterae were reported for the first time. The results were as follows： All the 21 taxa of Clematis were diploid with x = 8 （2n = 2x = 16）， the genome of each taxon had at least one pair of satellites except of C. tibetana. The chromosome of C. fusca， C. peterae， C. macropetala， C. aethusifolia， C. puberula var. tenuisepala， C. flammula were ‘2B’ type， C. acerifolia， C. fruticose， C. heracleifolia， C. intricate， C. grandidentata， C. brevicaudata， C. puberula var. tenuisepala， C. glauca， C. hexapetala， Clematis kirilowii， C. kirilowii var. chanetii， C. alpina var. ochotensis， C. tangutica， C. tibetana， C. tubulosa， C. vitalba were ‘2A’ type. The karyotype asymmetry coefficient ranged from 60.29% to 63.79%. The chromosomes of Clematis were primitive， and the karyotypes varied widely among species. Through the above research， we can draw the following conclusions： The chromosome number of Clematis should evolve from diploid to polyploid， and then aneuploidy be produced through the polyploid diploidization process. The chromosome evolution of Clematis is mainly carried out at the diploid level， which is realized by generating chromosome structural variation， and evolve through four ways： generating heterozygous chromosomes， strengthening karyotype asymmetry， chromosome type change and satellite chromosome change. At the same time， the karyotype characteristics of Clematis are basically consistent with the traditional classification at the section level and species level， which indicates that karyotype analysis can provide new reference basis for the classification of Clematis. The results of the present study have significant scientific values in the further studies on the taxonomy， phylogenetics and resources utilization in genus Clematis.

Key words： Clematis， chromosome， cluster analysis， karyotype analysis， cytology

鐵線蓮屬植物具有重要的經濟價值，一直以來都是我國常用的藥用植物，其屬下多種植物可起到鎮痛、抗炎、抗腫瘤等作用（馬迪，2010）。近年來，對其化合物方面的研究表明其含有三萜皂苷、黃酮、木脂素等成分（張亞梅等，2018）。鐵線蓮屬植物花果形態優美，適應性強，是優良的垂直綠化植物，為國內外常用的景觀花卉之一，具有極高的園藝觀賞價值（高露璐等，2017）。鐵線蓮屬（Clematis L.）分類學隸屬于毛茛科（Ranunculaceae），為毛茛科中的世界性大屬，有超過300個野生種類，廣泛分布于全球各地，其中我國有150余種（Wang & Bartholomew， 2001; 王文采和李良千，2005）。該屬種類繁多，在分類上一直是較難處理的一個類群。各國學者開展了大量的工作進行鐵線蓮屬的系統學研究，但在不同分類系統中對其屬下分類階元的劃分有較大區別（Tamura， 1995; Johnson， 1997; Grey-Wilson， 2000; 王文采和李良千，2005）。王文采和李良千（2005）基于形態特征將該屬劃分為四個亞屬，四亞屬下又分為15組。該研究為目前鐵線蓮屬最為全面的分類系統，且屬下分類群間的關系闡述清晰完整。然而，基于形態建立的分類系統對鐵線蓮屬植物的起源演化的解釋仍存在一定的問題，如屬下組間親緣關系仍不明確，而且分子系統學研究與形態分類存在巨大差別（Miikeda et al.， 2006; Xie et al.， 2011; Lehtonon et al.， 2016）。因此，澄清鐵線蓮屬的系統演化與屬下類群關系問題仍需收集更多性狀加以綜合判斷。

植物的核型反應了染色體演化的整體特征，研究物種的染色體及核型特征有助于判斷物種間的親緣關系和揭示其遺傳進化機制（劉華敏等， 2010）。許多植物的核型特征在種級、屬級乃至科級水平的分類中起到重要作用（王永，2007）。染色體與核型分析研究的重要性突出體現在毛茛科的分類學歷史當中（Langlet， 1927; Gregory， 1941;Tamura， 1995;孔宏智等，1997;楊親二，2000，2001a，b，2002）。二十世紀三四十年代，西方植物學家發現毛茛科中存在兩種類型的染色體（Langlet， 1927; Gregory， 1941），即大型染色體（R type）與小型染色體（T type）。此后該特征成為毛茛科分亞科的重要參考性狀（Tamura， 1995）。

鐵線蓮屬隸屬于銀蓮花族（Trib. Anemoneae），因而具有典型的大型染色體。因此，染色體及核型特征可能對鐵線蓮屬分類與系統發育判斷具有一定應用價值。但是，目前國內外針對染色體形態特征開展鐵線蓮屬的細胞學研究并未清楚闡明其與基于形態的分類研究的關聯，并有一定的局限性。同時鐵線蓮屬在世界范圍內廣泛分布，前人的研究對部分類群覆蓋范圍不夠完善，某些類群的染色體及核型特征數據不夠完整。因此，本研究開展了針對21個鐵線蓮類群的染色體數目及核型研究工作，其中5個類群的染色體數據為首次報道。本研究觀察了21個鐵線蓮類群的染色體，通過構建聚類樹分析其親緣關系，同時分析了已報道的鐵線蓮屬染色體數目與倍性，擬探討以下問題：（1）鐵線蓮屬染色體演化規律;（2）核型特征在鐵線蓮屬的分類學價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為19種2變種鐵線蓮屬植物，根據最新的分類系統，分屬7組，包含華北地區鐵線蓮屬植物組級的全部分類階元。試驗材料名稱及來源見表1。所有憑證標本存放在河北農業大學植物標本室（HBAU）。試驗材料均具活體植株，統一栽植于河北農業大學一分場試驗地。

1.2 試驗方法

于2020年8—9月期間，每種材料選取生長狀況良好，根系發達的10株容器苗，上午8：00—9：00取貼近盆壁的側根根尖分生區1～2 cm，取至少30條幼嫩根尖。將根尖置于冰水混合物中并在4 ℃冰箱預處理24 h;取出根尖用蒸餾水清洗 3～4 次，置于卡諾氏固定液 （無水乙醇∶冰醋酸 = 3∶1） 中固定 24 h;用蒸餾水沖洗，立即進行下一步解離或置于 70% 酒精中保存;將置于70%酒精中保存材料再次用蒸餾水清洗 3～4 次，加入1 mol·L-1的鹽酸并在60 ℃恒溫水浴鍋中進行解離 10 min;將根尖用蒸餾水清洗干凈，加入蒸餾水室溫下低滲1 h，使細胞吸水脹大;取根尖0.2 mm的乳白色分生區于載玻片上，并用吸水紙在一側吸干水分，滴改良卡寶品紅染液染色10 min，蓋上蓋玻片，輕敲，壓片，在Leica DM 4000顯微鏡下觀察，并拍照。

1.3 數據獲取與分析

每種鐵線蓮選出30個較好的分裂相，觀察并統計染色體數目。再從中選取5個形態清晰且分散最好的分裂相，通過Photoshop 2020進行摳圖配對，Image J測量臂長（徐煒楨等，2019），以這5個細胞各項數據的均值為參數值進行計算。根據Stebbins（1971）和李懋學等（1985）提出的核型分類標準，確定核型類型。Arano（1963）提出了核型不對稱系數（asymmetrical karyotype coefficient， AS.K%）和Levan等（1964）提出了根據臂比確定著絲點位置和分類的方法。用上述方法對21個鐵線蓮類群的核型進行研究。并以核型不對稱系數為縱坐標，平均臂比值為橫坐標作21個鐵線蓮類群進化趨勢圖。

對21個鐵線蓮屬植物的細胞學特征，包括核型不對稱系數、最長染色體/最短染色體值、平均臂比、著絲點指數、有無隨體、核型類型相關數值作為分類依據（盛璐，2011），選擇Ward聯接法，利用SPSS Statistics軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 鐵線蓮核型總體特征

根據染色體分裂中期鏡檢圖、染色體形態圖及核型模式圖（圖1，圖2，圖3）可以看出供試的鐵線蓮的染色體數目穩定，觀察的21個鐵線蓮屬植物染色體數目一致，為2n=2x=16，x=8，均為二倍體植物。所有種類的染色體相對長度范圍（8號染色體平均相對長度至1號染色體平均相對長度）、最長染色體與最短染色體比值、臂比值范圍、核型類型、核型公式、核型不對稱系數、著絲點指數、平均臂比等參數詳見表2。供試植物染色體類型由m、sm、st、t組成，多數為m型。除中印鐵線蓮外，均具隨體。供試材料染色體組中最長染色體與最短染色體比值平均值為1.89， 染色體組中臂比大于2∶1的染色體比例均為0.375， 平均臂比介于2.39～3.85之間。核型類型為“2A”和“2B”兩種類型，其中，太行鐵線蓮、狹裂太行鐵線蓮、槭葉鐵線蓮、甘青鐵線蓮、黃花鐵線蓮、棉團鐵線蓮、粗齒鐵線蓮、灌木鐵線蓮、半鐘鐵線蓮、粉綠鐵線蓮、大葉鐵線蓮、短尾鐵線蓮、卷萼鐵線蓮、中印鐵線蓮、Clematis vitalba的染色體為 “2A”型;長瓣鐵線蓮、鈍萼鐵線蓮、芹葉鐵線蓮、褐毛鐵線蓮、C. flammula、毛果揚子鐵線蓮的染色體為“2B”型。核型公式可概括為2n=2x=16=10m+0～2sm+0～6st+0～4t。本試驗中的21種鐵線蓮的核型不對稱系數的范圍是60.29%～63.79%。

2.2 核型進化趨勢分析

以平均臂比值為橫坐標，核型不對稱系數為縱坐標作染色體核型坐標圖如圖4。從中可以看出核型按雙向進化趨勢變化，粗齒鐵線蓮沿平均臂比方向進化趨勢快，黃花組的中印鐵線蓮、黃花鐵線蓮、甘青鐵線蓮沿核型不對稱性系數方向進化趨勢快。同時，被子植物的染色體核型系統演化趨勢是由對稱向不對稱發展（Stebbins，1971）。還可以看出越靠近右上方的類群，其進化程度越高。因此，芹葉鐵線蓮較靠近左下角，在核型上屬于比較原始的類群，鈍萼鐵線蓮、半鐘鐵線蓮、粉綠鐵線蓮較靠近右上角，在核型上屬于較為進化的類群。

2.3 聚類分析

基于核型不對稱系數、最長染色體與最短染色體比值、平均臂比、著絲點指數、有無隨體、核型類型等核型參數，運用上述方法進行了聚類，聚類結果見圖5。參照之前的分類處理（王文采和李良千，2005），由聚類結果可以看出，在歐氏距離10.0處，21個類群鐵線蓮被分為三類，第一類構成主要為威靈仙組成員，同時繡球藤組的槭葉鐵線蓮與灌木鐵線蓮組的灌木鐵線蓮也包含在內;第二類為黃花組、長瓣組、 大葉組以及威靈仙組的12個類群;第三類為威靈仙組的兩個種以及尾葉組的一個種。灌木鐵線蓮組與繡球藤組各只有一種參與聚類，均與威靈仙組的四種鐵線蓮聚到了一起。尾葉鐵線蓮組的芹葉鐵線蓮、褐毛鐵線蓮在歐氏距離25.0處才聚在一起，其親緣關系較遠。此外，太行鐵線蓮與其變種狹裂太行鐵線蓮在核型相關參數相似度較高，同時在聚類結果上也支持其親緣關系近。

3 討論與結論

3.1 鐵線蓮屬染色體演化規律

通過CCBD查詢已報道的鐵線蓮屬染色體數目可知，鐵線蓮染色體基數為8，并且存在二倍體、四倍體、六倍體、八倍體，分別對應2n=16、2n=32、2n=48、2n=64幾種類型，還具2n=36、2n=42、2n=44、2n=49、2n=50等非整數倍體。在鐵線蓮屬中， 2n=2x=16的二倍體占比最高，多倍化與非整數倍化現象并不多見，目前只在以下7個類群中有報道，如圓錐鐵線蓮、辣蓼鐵線蓮、吳興鐵線蓮、拔葜葉鐵線蓮、C. bourdillonii、C. theobromina、C. chinensis var. fujisanensis。染色體數目演化包括多倍化和非整數倍化兩種途徑（王家堅等，2016），多倍體被認為比其二倍體具更好的環境適應能力（Stebbins，1971;Brochmann et al.，2004），非整倍體的形成則通常與多倍體后代形成配子過程中異常減數分裂有關（Comai，2000），因此，鐵線蓮屬染色體數目應由二倍體向多倍體演化后通過多倍體的二倍化過程產生非整倍體方向演化。但上述七個類群均為二倍體與其他倍型的復合體，并未發現只存在多倍體或非整倍體的類群。因此，多倍體與非整數倍體在鐵線蓮屬演化過程中作用較小。對于鐵線蓮屬內多倍體及非整倍體的類群，其染色體數目演化與地理分布具有一定聯系。在喜馬拉雅地區（中國西南部、印度北部）及東亞地區，鐵線蓮屬多倍化與非整倍體化現象頻發。其中，八倍體圓錐鐵線蓮只在喜馬拉雅地區有過報道，分布于我國其他地區的圓錐鐵線蓮則為四倍體。這與Ziman（1981）認為我國西南部是鐵線蓮屬的起源與分化中心的觀點相吻合。

鐵線蓮屬染色體的演化通過產生染色體結構變異的方式主要在二倍體水平上進行。（1）產生雜合染色體，在太行鐵線蓮、狹裂太行鐵線蓮、長瓣鐵線蓮、灌木鐵線蓮、半鐘鐵線蓮、槭葉鐵線蓮6個類群中均發現有一對雜合染色體，分別位于5號染色體、5號染色體、4號染色體、6號染色體、1號染色體、4號染色體。（2）核型不對稱性加強，核型類型由“2A”演化為“2B”，如褐毛鐵線蓮、長瓣鐵線蓮、鈍萼鐵線蓮、毛果揚子鐵線蓮。（3）染色體類型的改變，即m型染色體演化為sm型染色體，sm型染色體演化為st型染色體，st型染色體演化為t型染色體。鐵線蓮屬染色體類型改變集中在第7和第8對染色體上，由st型向t型染色體轉變。如大葉鐵線蓮、粗齒鐵線蓮、短尾鐵線蓮、毛果揚子鐵線蓮、粉綠鐵線蓮和卷萼鐵線蓮（龔維忠等，1985;張鐿鋰和賀士元，1990;楊親二等，1994）。（4）隨體染色體具有多態性，在數量以及類型上鐵線蓮屬植物隨體存在一定水平的變異。根據Brat （1965） 的標準，鐵線蓮屬隨體類型包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型，其中Ⅲ型為主要類型。有的同時具有兩種或多種演化途徑。通過染色體結構演化可知，芹葉鐵線蓮較為原始，長瓣鐵線蓮、毛果揚子鐵線蓮、褐毛鐵線蓮、大葉鐵線蓮較為進化。這一結果得到了幼苗葉形態（Cheng et al.， 2016）及系統發育（Miikeda et al.， 2006; Lehtonon et al.， 2016）等研究的支持。染色體演化特征對屬下的系統親緣關系研究具有重要參考價值。

3.2 鐵線蓮屬染色體形態的分類學意義

毛茛科中鐵線蓮屬與錫蘭蓮屬具有密切的親緣關系這一點早有認識（Miikeda et al.， 2006; Xie et al.， 2011），在毛茛科最近的分子系統研究中，也支持將錫蘭蓮屬與互葉鐵線蓮屬歸并入鐵線蓮屬，這恰與錫蘭蓮屬和鐵線蓮屬具相同的染色體數目相吻合。對銀蓮花族的單型屬罌粟蓮花屬的研究顯示，罌粟蓮花具16條染色體，核型類型為“3A”，顯示其與鐵線蓮屬親緣關系近，較鐵線蓮屬“2A”或“2B”的核型類型，罌粟蓮花屬較為進化，獲得分子系統研究（Zhang et al.， 2015）的支持，結果顯示罌粟蓮花屬與鐵線蓮屬互為姊妹群。

21個鐵線蓮供試材料的聚類結果分析顯示，染色體核型研究在鐵線蓮亞屬一級未能獲得分類學支持，在組一級的分類研究中，能起到一定的參考。在盛璐（2011）和彭綠春等（2012）的研究中，同為鐵線蓮組的湖州鐵線蓮、重瓣鐵線蓮、毛葉鐵線蓮、C. viticella聚為一類，同為繡球騰組的滑葉藤與金毛鐵線蓮聚為一類。尾葉鐵線蓮組的核型研究卻與傳統分類學（王文采和李良千，2005）產生了沖突，盛璐（2011）的聚類結果顯示同為尾葉鐵線蓮組的寬柄鐵線蓮、日本鐵線蓮、褐毛鐵線蓮、C. crispa與單葉鐵線蓮、神農架鐵線蓮分別聚成兩類，但尾葉組的全緣葉鐵線蓮與毛蕊鐵線蓮卻并未表現出與上述類群親緣關系較近;在彭綠春等（2012）的研究中，尾葉組的長花鐵線蓮與毛茛鐵線蓮聚為一類。本研究中同屬尾葉組的芹葉鐵線蓮與褐毛鐵線蓮并未聚到一起，并顯示出較遠的親緣關系，威靈仙組的10個類群也分別聚為三類。以上結果均不能很好地支持傳統分類研究，卻得到了幼苗葉形態研究與基于分子的系統發育研究的支持，暗示了尾葉鐵線蓮組與威靈仙組并非單系群。而分子生物學（穆琳和謝磊，2011; 盛璐，2015; Yan et al.，2016; Liu et al.， 2018; Choi et al.， 2021）的研究結果，同樣支持中印鐵線蓮與甘青鐵線蓮、短尾鐵線蓮與大葉鐵線蓮與黃花鐵線蓮、棉團鐵線蓮與太行鐵線蓮的親緣關系較近，說明染色體核型研究與幼苗葉形態、分子系統學研究有一定的一致性。同時，本研究與盛璐（2015）的聚類結果還顯示太行鐵線蓮與狹裂太行鐵線蓮、芹葉鐵線蓮與寬芹葉鐵線蓮分別聚在一起，因此核型分析在種一級的分類上有一定的參考作用。對于不同居群的鐵線蓮，染色體核型分析可對其多樣性提供線索（王娜等，2017）。

本研究中所采集的槭葉鐵線蓮核型類型為“2A”，在染色體結構上是較原始的類群，與傳統分類中槭葉是較原始類群判斷一致，但與北京采集的槭葉鐵線蓮（“2B”）在核型類型上存在差異;取自南京的大葉鐵線蓮比取自北京、河北的不對稱性更低，在染色體結構上更為原始;山東采集的褐毛鐵線蓮與取自河北的核型類型也存在差異（龔維忠等，1985;王娜等，2017）。差異主要來自于不同居群進化程度不同，如環境發生改變，為在競爭中獲得優勢，就會比環境適宜的居群進化程度更高。本文中所采集的槭葉鐵線蓮居群為河北保定一新分布地，環境適宜，且在保護區中，人為干擾極少環境穩定，故其核型類型更加原始。

總之，染色體數目與核型分析在毛茛科科下的分類單元可提供一條明顯的線索，在鐵線蓮屬內顯示大多數種類符合組一級的分類，但并不能夠只依靠核型證據確定鐵線蓮在組一級的劃分，在該屬物種的劃分上也能提供一定的參考，為物種鑒定提供依據。而在種間的核型分析中，則顯示了不同居群具有較高的染色體形態變異。細胞學證據在鐵線蓮屬系統與分類研究中可起到一定的幫助，在今后的研究中應該擴大取樣并加強鐵線蓮屬染色體方面的研究。

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（責任編輯 李 莉）

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