利用葉綠體基因組數據解析錦葵科梧桐亞科的系統位置和屬間關系

黎若竹 蔡杰 楊俊波 張志榮 李德銖 郁文彬

摘 要：? 分子系統學研究將傳統梧桐科與錦葵科、木棉科和椴樹科合并為廣義錦葵科，并進一步分為9個亞科。然而，9個亞科之間的關系尚未完全明確，且梧桐亞科內的屬間關系也未得到解決。為了明確梧桐亞科在錦葵科中的系統發育位置，厘清梧桐亞科內部屬間系統發育關系，該研究對錦葵科8個亞科進行取樣，共選取55個樣本，基于葉綠體基因組數據，采用最大似然法和貝葉斯分析構建系統發育樹。結果表明：（1）廣義錦葵科中，刺果藤亞科和扁擔桿亞科組成Byttneriina分支，Malvadendrina分支中山芝麻亞科為其他亞科的姐妹群，隨后分出梧桐亞科（WCG、LSC和SSC矩陣構成的數據集），以及Malvatheca分支（木棉亞科和錦葵亞科）與非洲芙蓉亞科-椴樹亞科的姐妹關系。（2）在梧桐亞科中，可樂果屬分支（Cola clade）是獨立一支，隨后是酒瓶樹屬分支（Brachychiton clade）與蘋婆屬分支（Sterculia clade）+ 銀葉樹屬分支（Heritiera clade）形成姐妹關系（WCG、LSC和CDS矩陣）。（3）在可樂果屬分支中，可樂果屬為梧桐屬（含閉果桐屬）和胖大海屬+舟翅桐屬的姐妹群。該研究基于葉綠體基因組數據基本澄清了廣義錦葵科的亞科系統關系以及梧桐亞科內各屬關系，系統發育樹框架基本明晰，但梧桐亞科在Malvadendrina分支的位置和酒瓶樹屬在梧桐亞科的位置，以及梧桐屬的概念及范圍仍需進一步研究，尤其是結合核基因組數據進行分析。

關鍵詞： 梧桐亞科， 梧桐屬， 錦葵科， 系統發育基因組， 葉綠體基因組

中圖分類號：? Q949

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）01-0025-14

收稿日期：? 2021-03-24

基金項目：? 中國科學院重大科技基礎設施開放研究項目（2017-LSF-GBOWS-02）;云南省萬人計劃“青年拔尖人才” [Supported by the Large-Scale Scientific Facilities of the Chinese Academy of Sciences （2017-LSF-GBOWS-02）; Ten Thousand Talents Program of Yunnan for Top-Notch Young Talents]。

第一作者： 黎若竹（1996- ），碩士研究生，主要研究方向為保護生物學，（E-mail）liruozhu@xtbg.ac.cn。

*通信作者：? 郁文彬，博士，研究員，研究方向為植物系統演化，（E-mail）yuwenbin@xtbg.ac.cn。

Plastid phylogenomics resolving phylogenetic placement and

genera phylogeny of Sterculioideae （Malvaceae s. l.）

LI Ruozhu1，2， CAI Jie3， YANG Junbo3， ZHANG Zhirong3， LI Dezhu3， YU Wenbin1，4，5*

（ 1. Center for Integrative Conservation， Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Mengla 666303， Yunnan， China;

2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. The Germplasm Bank of Wild Species， Kunming Institute of Botany， Chinese

Academy of Sciences， Kunming 650201， China; 4. Center of Conservation Biology， Core Botanical Gardens， Chinese Academy of Sciences， Mengla

666303， Yunnan， China; 5. Southeast Asia Biodiversity Research Institute， Chinese Academy of Science， Mengla 666303， Yunnan， China ）

Abstract：? Phylogenetic analyses supported that four traditionally defined families Sterculiaceae， Tiliaceae， Bombacaceae and Malvaceae were subsumed into Malvaceae s.l. and nine subfamilies had been recognized within Malvaceae s.l. However， phylogenetic relationships among the nine subfamilies were not well resolved. Moreover， phylogenetic relationships among genera were also not clear in Sterculioideae. In this study， we reconstructed phylogenetic trees of Malvaceae s.l. based on chloroplast genome sequences from 55 species that representing eight recognized subfamilies for clarifying phylogenetics relationships of subfamilies and Sterculioideae. The results were as follows： （1） Byttnerioideae and Grewioideae formed the Byttneriina clade in Malvaceae s.l. as sister to the Malvadendrina clade which by having Helicteroideae as the first divergent subfamily， followed by Sterculioideae （WCG， LSC and SSC datasets）， and the Malvatheca clade （Bombacoideae + Malvoideae） and the clade Dombeyoideae + Tilioideae as sister. （2） The Cola clade was the first divergent clade in Sterculioideae， then the Brachychiton clade was sister to the clade Sterculia + Heritiera （WCG， LSC and CDS datasets）. （3） In the Cola clade， Cola + Octolobus + Pterygota were the first divergent group， then Firmiana spp. （including Hildegardia） were sister to the clade Scaphium + Pterocymbium. In this study， plastid phylogenomic analyses have well resolved the phylogenetic framework of subfamilies in Malvaceae s.l.， and phylogenetic relationship among genera in Sterculioideae. However， phylogenetic positions of Sterculioideae in the Malvadendrina clade and Brachychiton in Sterculioideae， respectively， as well as the concept and circumscription of Firmiana， need to confirm and further investigate using nuclear genomic data in the future.

Key words： Sterculioideae， Firmiana， Malvaceae， phylogenomics， chloroplast genome

傳統的梧桐科（Sterculiaceae）由Ventenat于1830年建立，模式屬是蘋婆屬（Steculia L.）。梧桐科隸屬于錦葵目（Malvales），是一個多型的科，擁有多樣的花部特征和果實類型（徐頌軍和徐祥浩， 2012）。由于缺乏關鍵的識別特征，不同學者在梧桐科的范圍和劃分上持有不同觀點，所包含屬種變動很大（Cronquist & Takhtajan， 1992; Takhtajan， 2009; 徐頌軍和徐祥浩， 2012）。形態上，梧桐科與同屬錦葵目的椴樹科（Tiliaceae）、錦葵科（Malvaceae）及木棉科（Bombacaceae）關系近緣，被認為是核心錦葵目（core Malvales）成員。從形態學來看，這4個科的形態特征十分相似，甚至有所重合，因而這幾個科的界限也不甚明確（徐頌軍和徐祥浩， 2000）。

分子系統學研究結果表明，錦葵目核心四科中唯有錦葵科是單系，其他3個科為多系或并系類群（Alverson et al.， 1999; Bayer et al.， 1999）。因為主要支系之間的形態分化水平不足以支持科級分類，所以Bayer等（1999）和Alverson等（1999）建議將4個科合并為1個大科，采用Malvaceae作為科名，并綜合考慮形態特征、生物地理學信息及系統發育結果，將錦葵科內部主要的9個分支處理為亞科等級。錦葵科的9個亞科分別為木棉亞科（Bombacoideae）、杯萼椴亞科（Brownlowioideae）、刺果藤亞科（Byttnerioideae）、非洲芙蓉亞科（Dombeyoideae）、扁擔桿亞科（Grewioideae）、山芝麻亞科（Helicteroideae）、錦葵亞科（Malvoideae）、 梧桐亞科（Sterculioideae）以及椴樹亞科（Tilioideae）。刺果藤亞科和扁擔桿亞科互為姐妹關系，組成Byttneriina分支，與余下7個亞科組成的Malvadendrina分支互為姐妹關系（Baum et al.， 1998; Alverson et al.， 1999）。在Malvadendrina分支內部，錦葵亞科與木棉亞科聚為一支，并得到良好支持（boot strap，BS=82%），這一分支被命名為Malvatheca（Baum et al.， 1998）。9個亞科的單系性及Byttneriina和Malvadendrina兩大分支在后續的研究中都得到了支持（Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019; Wang et al.， 2021）。在Malvadendrina分支內部，最先得到確定的是錦葵亞科和木棉亞科的姐妹關系（Alverson et al.， 1999; Baum et al.， 2004），其他亞科的系統位置則因取樣的多少及使用的基因片段不同而發生變動（Nyffeler et al.， 2005; Conover et al.， 2019; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019）。葉綠體基因組較基因片段包含更為豐富的遺傳變異信息，如今測序技術日臻完善，測序成本隨之降低，葉綠體基因組也被用于解決錦葵科系統發育關系（Wang et al.， 2021）。通過對錦葵目的39個葉綠體基因組（包括錦葵科8個亞科，缺少杯萼椴亞科）劃分的不同數據集進行系統發育分析，Wang等（2021）確定了山芝麻亞科處在Malvadendrina分支基部，為其他亞科的姐妹群，椴樹亞科和非洲芙蓉亞科為姐妹關系。然而，梧桐亞科與Malvatheca分支，及椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支之間的關系尚未得到解決。

基于現有分子系統學證據，傳統梧桐科的屬主要分散在刺果藤亞科、非洲芙蓉亞科、山芝麻亞科中，另有一屬（Fremontodendron Coville）被歸入木棉亞科，只有原蘋婆族（Sterculieae）及蝴蝶樹族（Tarritieae）的部分屬為梧桐亞科的主要成員（Bayer & Kubitzki， 2003）。新界定的梧桐亞科包含12～13屬，主要取決于是將Argyrodendron F. Muell.并入銀葉樹屬（Heritiera Aiton），還是作為一個獨立的屬（Bayer & Kubitzki， 2003; Wilkie et al.， 2006）。梧桐亞科的單系性得到了分子系統學和形態學證據的共同支持。在形態結構上，梧桐亞科各屬以無花瓣的花、花瓣狀的萼片、心皮離生、具雌雄蕊柄等共有特征和其他亞科區分開來（Bayer et al.， 1999; Bayer & Kubitzki， 2003）。包含梧桐亞科各屬的ndhF基因所構建的系統發育樹表明，梧桐亞科內部分為四個分支，即可樂果屬分支（Cola clade）、酒瓶樹屬分支（Brachychiton clade）、蘋婆屬分支（Sterculia clade）及銀葉樹屬分支（Heritiera clade）（Wilkie et al.， 2006）。然而，這四個分支之間的關系尚未得到解決，且分支內部屬間關系尚不明確，有待進一步探究。

本研究通過對錦葵科各亞科尤其是梧桐亞科進行取樣，盡可能多地獲取淺層測序數據及葉綠體基因組數據，利用葉綠體基因組數據重建錦葵科及梧桐亞科系統發育關系，以期明確梧桐亞科在錦葵科中的系統發育位置，并厘清梧桐亞科內部屬間系統發育關系。

1 材料與方法

1.1 材料采集與數據來源

（1）葉綠體基因組數據的獲取：從活植株上采集無病蟲害的幼嫩葉片，經硅膠干燥后，用于DNA的提取及測序。本研究新測了錦葵科19屬的29種植物的葉綠體基因組數據，并從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了26個錦葵科及1個紅木科的葉綠體基因組數據，共計56個樣本用于分析。其中，55個錦葵科樣本中代表了8個亞科35屬55種，缺少杯萼椴亞科（Bayer & Kubitzki， 2003），涵蓋原梧桐科的26個屬（徐頌軍和徐祥浩，2012）。樣本具體信息詳見表1。

（2）葉綠體片段數據的來源：為了進一步闡明梧桐屬（Firmiana Marsili）與閉果桐屬（Hildegardia Schott & Endl.）之間的關系，在Wilkie等（2006） 的取樣基礎上，增加了matK和rbcL基因片段進行聯合分析。數據主要從NCBI數據庫中下載，并從本研究選取的葉綠體基因組數據樣本中提取相應片段進行補充，詳見表1。

1.2 DNA提取及測序

DNA的提取采用改良CTAB法（Doyle JJ & Doyle JL， 1987），從硅膠干燥后的DNA分子材料中提取總DNA。用于文庫構建的DNA質量要求為總DNA含量≥1.5 μg，濃度≥20 ng·μL-1。每個樣品的總DNA為0.2 μg，通過超聲波將DNA隨機打斷成350 bp 或500 bp左右的片段，之后對DNA末端進行修飾補齊。接著給每個樣品添加標簽混合建庫，每個物種確保獲取4～5 G的測序數據。純化后的DNA于Illumina測序平臺上進行雙末端測序，采用的測序策略為PE150或PE250，即單端測序reads長度為150 bp或250 bp。由中國科學院昆明植物研究所中國西南野生生物種質資源庫和天津諾禾致源公司的Mi-Seq和Nova-Seq 6600高通量測序儀進行測序。

1.3 細胞器基因組數據組裝及注釋

高通測序獲得的原始數據直接利用GetOrganelle軟件包（Jin et al.， 2020）進行組裝，并自動輸出完整的環狀葉綠體基因組。若未能輸出環狀結構，可通過Bandage查看，手動對剔除非目的contigs后的FASTG文件進行編輯，輸出可靠的葉綠體基因組的contigs或scaffolds，之后利用手動校正和拼接成完整的葉綠體基因組。葉綠體基因組的注釋以發表的云南梧桐（NC_037242）為參考序列，通過Geneious（https：//www.geneious.com）進行基因組的相似性注釋，并結合ORF（open reading frames）進行校正。

1.4 系統發育分析

葉綠體全基因組和DNA片段分別進行比對和系統發育分析，用以推斷梧桐亞科與錦葵科其他亞科間以及梧桐亞科內部屬間的系統發育關系。基于葉綠體基因組數據的特征，本研究構建了5個數據集矩陣進行分析：（1）葉綠體全基因組（whole chloroplast genome，WCG）;（2）蛋白質編碼區（coding sequence， CDS）;（3）大單拷貝區（large single copy region，LSC）;（4）小單拷貝區（small single copy region，SSC）;（5）反向重復區（inverted repeat region，IR）。為了減少重復序列的影響，全基因組數據集去除了一個IR區，CDS數據集中所有基因都是唯一的。CDS基因利用Geneious軟件基于基因注釋信息進行提取，并使用Geneious的Mafft Multiple Aligenment插件對每個基因進行單獨比對，再通過concantenate_fasta.py（https：//github.com/Kinggerm/PersonalUtilities）將CDS基因串聯起來，用于矩陣的構建。數據矩陣和注釋質體基因組序列已上傳到Figshare共享平臺（Https：//doi.org110.6084/mq.figshare.14308682）。

所有用于系統發育的葉綠體基因片段或全基因組（僅保留一個IR）數據矩陣，均先使用MAFFT Online version（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）進行矩陣比對。比對結果于Geneious（Kearse et al.， 2012）進行查看，如有需要則對其進行手動調整和校正，之后再用于系統發育分析。系統發育樹的構建于CIPRES平臺（http：//www.phylo.org）上進行。所有數據集均采取最大似然法（maximum likelihood，ML），選用RAxML 8.2.12工具，選擇了GTRCATI模型，并設置1 000次靴帶值估算分支的支持率（BS）。此外，葉綠體全基因組（WCG）、CDS數據集及用于推斷可樂果屬分支系統發育關系的葉綠體基因片段還進行了貝葉斯分析（Bayesian inference，BI）。貝葉斯分析于CIPRES平臺（Miller et al.， 2010）的Mrbayes 3.2.7a進行，最佳替代模型依據貝葉斯信息準則（Bayesian information criterion），通過jModeltest2 2.1.6（Darriba et al.， 2012）來確定。四條馬爾科夫-蒙特卡洛鏈（Markov Chain Monte Carlo）運行了20萬或50萬代，每100代取樣一次，前25%的樹將作為老化樹被丟棄。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組特征

錦葵科29個新葉綠體基因組都是呈現典型的四分體結構，即包含一個大單拷貝區和一個小單拷貝區，并由兩個反向重復區將其分隔開來。錦葵科植物基因組的大小在159 093（Sparrmannia sp.）～165 106 bp（Helicteres isora）范圍內變動。基因組各部分大小范圍如下：LSC區88 380～90 064 bp;SSC區19 640～20 774 bp;IR區25 233～26 784 bp（表2）。

錦葵科植物葉綠體基因組在基因數量及順序上較為保守，其GC含量也未表現出明顯的差異。錦葵科葉綠體基因組包含113～114個不重復基因，由79～80個編碼基因（僅Guazuma ulmifolia 和Helicteres isora 丟失infA基因）、30個tRNA基因和4個rRNA基因組成。基因組GC含量范圍為36.5%～37.4%，其中，LSC區GC含量范圍為34.3%～35.3%，SSC區GC含量范圍為30.5%～31.9%，IR區GC含量范圍為41.8%～43.2%。

2.2 系統發育分析

2.2.1 矩陣特征 本研究基于葉綠體基因組數據劃分了5個數據集，由此所構建的矩陣特征如下：WCG數據構建的矩陣長度為177 659 bp，包含45 961個變異位點（variable site）和21 198個簡約信號位點（parsimony-informative site）。CDS數據集構建的矩陣長度為74 576 bp，包含15 304個變異位點和7 040個簡約信號位點。LSC數據集所構建的矩陣長度為123 778 bp，包含34 899個變異位點和16 033個簡約信號位點。SSC數據集所構建的矩陣長度為27 633 bp，包含變異位點8 975個和簡約信號位點4 387個。IR數據集所構建的矩陣長度為37 370 bp，包含變異位點2 353個和簡約信號位點683個。

基于3個葉綠體基因片段（ndhF、matK和rbcL）所構建的矩陣長度為5 181 bp，包含226個變異位點和91個簡約信號位點。

2.2.2 基于葉綠體基因組的系統發育分析 以紅木（Bixa orellana）作為外類群，基于葉綠體基因組各數據集，采用最大似然法分別構建相應的ML樹，系統發育結果如圖1所示。在基于不同數據集構建的ML樹中，WCG和LSC數據集的ML樹拓撲結構完全一致。SSC數據集的ML樹在亞科關系上與WCG、LSC數據集表現一致，但在梧桐亞科內部存在一些差異;基于CDS數據集構建的ML樹在亞科關系上與前三個數據集有所不同，但在梧桐亞科內部與WCG、LSC數據集呈現一致。IR數據集構建的ML樹所呈現的拓撲結構無論是在亞科位置，還是梧桐亞科內部屬間關系上均與WCG、LSC數據集存在差異。

錦葵科8個亞科的單系性得到了除IR數據集以外其他四個數據集的支持，同時Byttneriina和Malvadendrina兩大分支，錦葵亞科和木棉亞科的姐妹關系（即Malvatheca分支）都得到了所有數據集的強烈支持。在IR數據集構建的ML樹中，榴梿（Durio zibethinus）并未置于山芝麻亞科，而是作為Malvadendrina分支其他屬的姐妹群，隨后為山芝麻亞科的其他屬，但支持率較弱（BS=38%）;除此以外，其拓撲結構與WCG數據集的ML樹一致，但大部分節點支持率偏低。非IR數據集中，在Malvadendrina分支內部，山芝麻亞科置于基部，為分支內余下亞科的姐妹群;椴樹亞科和非洲芙蓉亞科互為姐妹關系。但是，梧桐亞科、Malvatheca分支，以及椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支間的位置關系在不同數據集中存在分歧。WCG、LSC和SSC數據集的ML樹均顯示Malvatheca分支與椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支聚在一起（BSWCG=97%， BSLSC=96%， BSSSC=77%，而在CDS數據構建的ML樹上Malvatheca與梧桐亞科的關系更近（BS=81%）。

原梧桐科的屬被分散到錦葵科的四個亞科中，梧桐亞科的成員主要來自原蘋婆族和蝴蝶樹族，其余屬則被分到刺果藤亞科、非洲芙蓉亞科和山芝麻亞科中（表3）。在梧桐亞科內部，各屬的不同樣本均很好地各自聚成單系，可識別到四個分支，分支名稱沿用Wilkie等（2006） 的命名，即可樂果屬（Cola Schott & Endl.）、梧桐屬（Firmiana Marsili）、胖大海屬（Scaphium Schott & Endl.）及舟翅桐屬（Pterocymbium R. Br.）組成可樂果屬分支;酒瓶樹屬

（Brachychiton Schott & Endl.）、銀葉樹屬（Heritiera）及蘋婆屬（Sterculia L.）三屬各自形成單獨的分支。在可樂果屬分支內，可樂果屬為其他屬的姐妹群，隨后是梧桐屬和胖大海屬-舟翅桐屬的姐妹關系。蘋婆屬與銀葉樹屬的姐妹關系在WCG、LSC及CDS構建的ML樹上得到高度支持，但在SSC構建的ML樹上的支持率較弱;酒瓶樹屬的位置在各ML樹中呈現不一致（圖1）。

BI分析構建的系統發育樹在結構上與ML分析所產生的系統發育樹的拓撲結構一致。較ML分析而言，基于WCG數據集構建的BI樹，進一步支持了Malvatheca分支與椴樹亞科-非洲芙蓉亞科的近緣關系（圖2）。與之相反的是，基于CDS數據集構建的BI樹在Malvatheca與梧桐亞科組成的分支節點的支持率降低（posterior probability， PP=0.71）。

2.2.3 基于葉綠體片段序列的系統發育分析 為了進一步探究梧桐屬和閉果桐屬的界限與關系，我們基于葉綠體基因ndhF、matK和rbcL聯合矩陣構建ML樹和BI樹，重建可樂果屬分支的系統發育關系（圖3）。增加了matK和rbcL片段的矩陣，Sterc. 梧桐亞科; Dombey. 非洲芙蓉亞科; Til. 椴樹亞科; Bom. 木棉亞科; Malv. 錦葵亞科; M. Malvatheca; Helict. 山芝麻亞科; Bytt. 刺果藤亞科; Grew. 扁擔桿亞科; O. 外類群。★表示bootstrap值為100%。在A、D中，WCG的bootstrap值標注上方，LSC/SSC（CDS）的標在下方。

Sterc. Sterculioideae; Dombey. Dombeyoideae; Til. Tilioideae; Bom. Bombacoideae; Malv. Malvoideae; M. Malvatheca; Helict. Helicteroide; Bytt. Byttnerioideae; Grew. Grewioideae; O. Outgroup. ★ indicates that bootstrap value is 100%. In A & D， numbers above the branches indicate bootstrap support values as revealed with WCG， numbers in the below branches indicate bootstrap support values of LSC/SSC（CDS）.

明顯提高了部分節點的支持率，并依然支持梧桐屬是一個并系類群，即來自閉果桐屬的Hildegardia barteri與火桐（Firmiana colorata）、馬來火桐（F. malayana）及美麗火桐（F. pulcherrima）聚為一支（BS=81%， PP=0.97），而Hildegardia populifolia與梧桐（Firmiana simplex）、丹霞梧桐（F. danxiaensis）以及云南梧桐（F. major）組成另一支（BS=90%， PP=1.00）。

3 討論與結論

3.1 錦葵科亞科間系統發育關系

本研究基于葉綠體基因組數據，用不同的數據集分別采用最大似然法和貝葉斯分析進行系統發育分析，在亞科水平上提供了對錦葵科系統發育關系更好的理解。系統發育分析結果表明，錦葵科8個亞科均為單系（IR數據集除外），亞科間分為Byttnerrina和Malvadendrina兩大分支，在Malvadendrina分支內錦葵亞科與木棉亞科組成Malvatheca分支。這些關系與前人的研究結果一致（Bayer et al.， 1999; Alverson et al.， 1999; Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019），且得到了各數據集的一致支持，

但亞科之間的關系在數據集間存在一定差異。

在Malvadendrina分支內，非IR數據集構建的系統發育樹都將山芝麻亞科置于該分支基部，作為其他亞科的姐妹群（BS=100%， PP=1.00）。山芝麻亞科的位置與先前基于葉綠體基因數據的系統發育分析結果一致（Conover et al.， 2019; Wang et al.， 2021），不過核基因數據卻支持非洲芙蓉亞科在這一位置，隨后才是山芝麻亞科與余下亞科的姐妹關系（Conover et al.， 2019）。同樣利用葉綠體基因片段atpB、matK和ndhF聯合分析的結果也支持非洲芙蓉亞科為Malvadendrina分支其他亞科的姐妹群（Nyffeler et al.， 2005）。另有研究表明，非洲芙蓉亞科處在如下位置：（1）與椴樹亞科互為姐妹關系（Alverson et al.， 1999; Wang et al.， 2021）;（2）作為梧桐亞科-杯萼椴亞科的近緣姐妹群（Bayer et al.， 1999）。在本研究中，包括CDS數據集在內的所有數據集都強烈支持非洲芙蓉亞科和椴樹亞科的姐妹關系（BS=100%， PP=1.00）。此外，在本研究中，WCG數據集的ML分析和BI分析結果均強烈支持椴樹亞科-非洲芙蓉亞科和Malvatheca分支的姐妹關系（BS=100%， PP=1.00）。然而，在同樣的分析中，CDS數據則與之前多基因片段聯合分析的結果一致（Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019），這表明梧桐亞科為Malvatheca分支的姐妹群（BS=81%， PP=0.71）。與之相反，Wang et al. （2021） 用葉綠體CDS基因構建的錦葵科系統發育關系卻顯示梧桐亞科與椴樹亞科-非洲芙蓉亞科分支構成姐妹關系，這種差異可能是取樣差異所造成。

在我們的分析中，WCG和CDS數據集的沖突可能源于數據的進化速率不同。相對基因編碼區而言，非編碼區序列擁有更快的進化速率，能提供更多具系統學意義的信息位點（田欣和李德銖，2002）。同時，數據集之間的沖突，也反映出錦葵科演化歷史的復雜。Malvadendrina分支中亞科之間的莖干枝長較短，表明這些支系可能存在快速分化，適應性輻射，由此可能造成不完全譜系分選的發生（黃原，2012）。此外，該分支還存在全基因組多倍化事件，存在異源多倍體（Conover et al.， 2019）。

在IR數據集中，榴梿為該分支其他屬的姐妹群，隨后是山芝麻亞科。盡管在形態上難以將山芝麻亞科的成員榴梿族（Durioneae）和狹義山芝麻亞科（Helictereteae s. str）聯系起來，但是山芝麻亞科單系性一直以來都得到分子數據的良好支持（Bayer et al.， 1999; Alverson et al.， 1999; Nyffeler et al.， 2005; Hernandez-Gutierrez & Magallon， 2019）。但IR數據集中，山芝麻亞科未能形成單系，這與Wang等（2021） 用IR區構建的系統發育樹一致。IR數據集與其他數據結果的沖突可能是由于與單拷貝區相比，IR區的核苷酸替代速率更低 （Zhu et al.， 2016），提供的系統發育信息有限。

此前，Malvadendrina分支各亞科的關系一直未能得到完全解決，由于取樣類群和數據類型的不同，亞科之間的位置關系隨之變動。Alverson等（1999） 嘗試從形態學上為這些亞科的關系提供一些參考，他們認為萼片的離生與合生以及花絲離生或合生成柱可能與亞科的關系聯系起來。同時，他們指出在椴樹亞科和非洲芙蓉亞科中，萼片離生僅在基部稍微連合;反之，杯萼椴亞科、山芝麻亞科、梧桐亞科及Malvatheca的成員萼片合生，呈管狀或鐘狀，常淺裂。另外，雄蕊管（即花絲部分或完全合生）為Malvatheca分支、大部分山芝麻亞科成員，非洲芙蓉亞科及梧桐亞科所共有，可能表明了杯萼椴亞科與椴樹亞科的基本位置。然而在梧桐亞科中也存在花萼分離及合生兩種情況（Tang et al.， 2007），這說明花萼特征可能不是椴樹亞科和非洲芙蓉亞科的共享衍征。從形態上來看，梧桐亞科被認為是Malvatheca分支潛在的姐妹群。因為從花部形態來看，梧桐亞科的花藥無柄或近無柄，這與Malvatheca分支中早期分化的成員特征相同（Von Balthazar et al.， 2006），且梧桐亞科和Malvatheca分支中的大多數屬都缺少在其他亞科中顯著存在的退化雄蕊（Nyffeler et al.， 2005）。但是梧桐亞科與其他亞科相比有其獨有的特征，即離生心皮、花常單性且無花瓣、具雌雄蕊柄等特征同時在梧桐亞科植物上出現（Bayer & Kubitzki， 2003; 李德銖等，2020）。山芝麻亞科的單系性一直以來都得到分子數據的良好支持，但在形態上難以將狹義山芝麻亞科和榴梿族聯系起來。例如雌雄蕊柄是狹義山芝麻亞科最顯著的花部結構，卻在榴梿族中缺失（Alverson et al.， 1999; Nyffeler et al.， 2005）。目前，已有的研究尚不足以在形態上解釋本研究中所展示的Malvadendrina分支各亞科的系統發育關系，仍有待進一步研究。

3.2 梧桐亞科屬間系統發育關系

傳統的梧桐科是一個多型的科，包含極為豐富的花部形態和果實類型。為了更好地理解梧桐科植物之間的關系，分類學家們依據形態學、孢粉學、解剖學等特征將梧桐科植物劃分了亞科或（和）族（Cronquist & Takhtajan， 1992; Takhtajan， 2009; 徐頌軍和徐祥浩， 2012）。然而，對于梧桐科所包含的范圍和屬種數目，不同學者看法不一。據Takhtajan （2009） 統計，全世界有梧桐科植物62屬1 500種，而徐頌軍和徐祥浩（2012）則認為梧桐科有60屬1 548種。分子系統學證據表明傳統梧桐科是一個多系，隨后將梧桐科與錦葵科、木棉科及椴樹科合并為廣義錦葵科，并將其內部劃分為9個亞科，而傳統的梧桐科被劃分到5個亞科之中（Bayer et al.， 1999; Alverson et al.， 1999）。其中，梧桐亞科僅保留了原來蘋婆族和蝴蝶樹族的屬，其單系性得到了形態和分子證據的較好支持（Bayer & Kubitzki， 2003; Wilkie et al.， 2006）。然而基于葉綠體片段的系統發育分析，不足以提供足夠的分辨率以解決梧桐亞科內部屬間的系統發育關系。本研究基于葉綠體基因組重建了梧桐亞科屬間系統發育關系，結果與基于梧桐亞科13個屬的葉綠體ndhF基因進行的系統發育分析結果一致（Wilkie et al.， 2006），均在梧桐亞科內部識別到四個分支。與之相比，本研究的分析結果進一步支持可樂果屬為其他屬的姐妹群以及梧桐屬和舟翅桐-胖大海屬的姐妹關系。此外，蘋婆屬分支和銀葉樹屬分支的姐妹關系也得到了各數據集（除IR數據集外）的強烈支持。而酒瓶樹屬分支有如下3個位置：（1）蘋婆屬-銀葉樹屬的姐妹群（BSWCG=68%， BSLSC=98%， BSCDS=92%）;（2） 可樂果屬分支（Cola clade）的姐妹群（BSSSC=67%）;（3）梧桐亞科余下屬的姐妹群（BSIR=80%）。酒瓶樹屬位置在IR區和SSC區構建的系統發育樹中發生變動，可能的原因是IR區和SSC區較短，包含的變異位點較少。

3.3 梧桐屬的范圍與界定

在梧桐屬內部，一類是花于葉前開放，花萼5淺裂，萼筒遠長于裂片，如火桐、廣西火桐等;另一類則花葉同放，花萼5裂至近基部，如梧桐、丹霞梧桐等（Tang et al.， 2007）。因此，Ridley （1934） 主張將與火桐開花習性與花部形態一致的幾個種從梧桐屬中分出，獨立為火桐屬（Erythropsis Lindley ex Schott & Endlicher）。同時，蓇葖果中種子的數量也作為劃分兩屬的依據，Ridley指出火桐屬每蓇葖果含種子2枚，而梧桐屬每蓇葖果具種子4枚。這一觀點得到了徐頌軍和徐祥浩（2012）的認同，且凡強等（2011）基于ITS序列進行的系統發育分析也為這一處理提供了分子證據。然而，Kostermans （1954， 1957） 指出花萼筒長度變異的現象普遍存在于梧桐科（Sterculiaceae）多個屬中，而每蓇葖果種子數的不同則體現了種間差異，而非屬間差異，因而不贊成將梧桐屬分為兩屬。在Flora of China（Tang et al.， 2007）及《中國維管植物科屬志》（李德銖等，2020）中均未將火桐屬從梧桐屬中分出。

此外，中國境內的新記錄種克氏梧桐[Firmiana kerrii（Craib） Kosterm]及新發表的大圍山梧桐（Firmiana daweishanensis Gui L. Zhang & J. Y. Xiang）的花在展葉前開放，萼片深裂近基部（王文廣等，2019; Zhang et al.， 2020），兼具火桐的開花習性與梧桐的花部特征，處在二者的過渡狀態。由此可見，開花習性及形態的差異不足以作為分屬的依據。這種差異可能是由于快速分化造成的，可考慮與地理分布等信息結合起來，進一步探究梧桐屬的物種形成問題。另外，與僅使用ndhF基因進行最大似然法分析的結果一致（Wilkie et al.， 2006），我們使用ndhF、matK和rbcL聯合矩陣構建的系統發育樹中也顯示梧桐屬與閉果桐屬的樣本未能各自形成單系。閉果桐屬Hildegardia barteri和同樣具有管狀花萼的火桐等聚為一支，而花萼深裂至近基部的H. populifolia則和梧桐等分在一支。Kostermans （1954） 曾依據蓇葖果的開裂與否作為兩屬劃分的依據，但顯然分子證據并不支持這樣的分類界定。因此，基于開花習性，花的形態特征差異，以及蓇葖果的開裂與否劃分狹義梧桐屬、火桐屬和閉果桐屬并沒有系統發育證據的支持。因此，現采用的梧桐屬定義包括火桐屬和閉果桐屬物種在內。

3.4 梧桐屬研究展望

根據最新的資料，我國有廣義梧桐屬植物10種，多半是中國特有種（Tang et al.， 2007; 王文廣等，2019; Zhang et al.， 2020）。除梧桐在園林中廣泛栽培外，大多種均分布狹窄，甚至處于瀕危狀態。如丹霞梧桐僅在廣東省仁化縣及南雄市的丹霞地貌及英德的石灰巖山體上發現（繆紳裕等，2020）;大圍山梧桐僅在云南大圍山地區分布（Zhang et al.， 2020）。早在1999年頒布的《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》中，丹霞梧桐、海南梧桐及廣西火桐就被評為國家二級保護植物，而云南梧桐因于1998年被《IUCN瀕危物種紅色名錄》認定野外滅絕未被收錄。后來云南梧桐在金沙江流域被重新發現，但總數不超過4 000株，且暴露于人類的干擾之中，仍具有高度的滅絕風險（王大紹， 2001; Li et al.， 2020）。名錄近二十年未有更新，直至2018年國家林業和草原農業農村部才啟動了重點保護名錄的調整和修訂工作，并于2020年共同形成了《國家重點保護野生植物名錄（征求意見稿）》。在該名錄中，梧桐屬（除梧桐外）所有種均被列為國家二級保護植物。目前（截至收稿）正式版尚未頒布，但其關于梧桐屬植物保護等級的調整和修訂，足以反映出梧桐屬植物保護的迫切性與重要性。

梧桐屬植物數量較少，對環境的反應較為敏感，更容易喪失遺傳多樣性，滅絕風險極高，對梧桐屬植物的保護刻不容緩。雖然閉果桐屬物種我國不產，但從文獻和標本記錄來看很多物種分布區非常狹窄，同樣急需保護（Zaborsky， 2009; Rao et al.， 2011;Darbyshire & Rokni 2020;）。本研究中獲取的閉果桐屬物種只是基于NCBI上兩個物種的序列，未能很好地澄清閉果桐屬與狹義梧桐屬和火桐屬關系。同時，本研究中梧桐屬物種取樣不足，內部種間的關系也沒有厘清。在未來的研究中，需要獲取更多的樣本，使用信息更為豐富的基因組數據來對廣義梧桐屬的關系做進一步探究，同時從更廣泛的物種和居群取樣探討梧桐屬的物種演化關系，以便更好地解析梧桐屬物種多樣化的形成機制。

致謝 本研究得到了中國西南野生生物種質資源庫大科學工程項目、國家重要野生植物種質資源庫、中國科學院西雙版納熱帶植物園園林園藝部及公共技術服務中心超算平臺的支持;中國科學院西雙版納熱帶植物園林露湘老師、譚運洪老師、丁洪波老師，中國科學院植物研究所劉冰老師為本研究提供材料，在此一并致謝。

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（責任編輯 何永艷）

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