血清6型鴨疫里默氏桿菌發酵工藝與攻毒模型的建立

崔松奇，饒瀟君，趙海明，田春利，閻燊，張文芳，張丹丹，李娥，劉洋，余海濤，劉興剛，孔敏，高月花，胡峰，黃兵，李玉峰

摘 要：本試驗對不同地區分離的3株血清6型鴨疫里默氏桿菌，通過搖瓶試驗篩選出血清6型鴨疫里默氏桿菌適宜的增菌液體培養基和細菌計數培養基，通過5L發酵罐各菌株生長曲線的對比，篩選出適合工業化發酵的菌株以及發酵工藝參數，通過鴨疫里默氏桿菌疾病模型條件篩選確立了攻毒模型。結果顯示：WF201910株和TA201912株適宜的增菌液體培養基為商品化的RA培養基，LY202001株適宜的增菌液體培養基為商品化的TSB培養基，三個菌株適宜的細菌計數培養基均為TSA培養基;5 L發酵罐發酵TA201912株在RA液體培養基最高菌數可以達到3.28×1010 CFU/mL，通過500 L發酵罐放大工藝驗證，該工藝參數適合于規模化生產;4周齡雛鴨腿部肌肉注射鴨疫里默氏桿菌3 d后開始發病，發病與死亡高峰期為攻毒后3～6 d，臨床癥狀與病原學鑒定均符合血清6型鴨疫里默氏桿菌疾病。本試驗為血清6型鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的研制打下了基礎。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;血清型;發酵工藝;攻毒模型

中圖分類號：S858.32 文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2022）01-0012-08

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種高致病性、接觸性傳染病，又稱鴨傳染性漿膜炎（infectious serocitis，IS），可引起雛鴨和雛鵝的肝周炎、纖維素心包炎和氣囊炎等，因死亡、消瘦、淘汰、胴體品質下降、疾病治療等造成巨大的經濟損失[1]。

鴨疫里默氏桿菌主要感染1～8周齡，尤其是2～3周齡的雛鴨，引起多發性、滲出性炎癥和全身性敗血癥[2]。臨床上主要表現為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟失調和頭頸震顫，慢性經過的病鴨主要表現為腦膜炎癥狀、頸斜、生長緩慢或成僵鴨。剖解病變以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征[3-5]。鴨疫里默氏桿菌病發病率可達90%以上，死亡率高達75%。該病在世界范圍內廣泛流行，是目前危害養鴨業最為嚴重的細菌性傳染病之一，給養鴨業造成巨大經濟損失[3]。

通過對近3年200余株鴨疫里氏桿菌的分離鑒定，以及相關報道，目前鴨疫里默氏桿菌的流行血清型主要有血清1型、2型、6型、7型，占分離菌株的80%以上。目前商品化的鴨傳染性漿膜炎疫苗有1型、2型、4型、7型的、10型二價或三價疫苗以及與大腸桿菌的二聯滅活疫苗，由于鴨疫里默氏桿菌各血清型之間交叉保護效果不好，而且缺少商品化的血清6型鴨疫里默氏桿菌的相關疫苗，在國家禁抗、限抗的大背景下，血清6型鴨疫里默氏桿菌在部分養鴨地區成為了主要的流行菌株，給養殖戶造成了很大的損失，因此開展血清6型鴨疫里默氏桿菌的研究，開發出含有血清6型鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗迫在眉睫。

1 材料

1.1 試驗動物

190只25～30日齡肉鴨，由河北廊坊種鴨場提供。

1.2 菌株

血清6型鴨疫里默氏桿菌WF201910株、TA201912、LY202001株，由山東省農業科學院家禽研究所提供。

1.3 培養基

TSA、TSB 培養基均由本試驗室配制。

RA專用液體培養基與固體培養基購自洛陽宏順技術有限公司。

1.4 主要儀器

BIOTECH 型發酵罐（5 L），購自上海保興生物設備工程有限公司;500 L生產規模發酵罐，購自青島某設備科技有限公司;紫外可見分光光度計，購自尤尼柯儀器有限公司。

2 方法

2.1 培養基篩選

取冷凍保存的血清6型鴨疫里默氏桿菌WF201910株、TA201912、LY202001株，每株細菌分別接種于TSB與RA專用液體培養基中，37 ℃培養24 h，TSB活化的細菌劃線于TSA固體平板，RA專用液體培養基活化的細菌劃線于RA專用固體平板，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。挑選凸起、邊緣整齊、奶油狀、透明、光滑菌落，TSA平板培養的菌落接種于TSB液體培養基中，RA專用固體平板培養的菌落接種于RA專用液體培養基中，37 ℃培養18 h。TSB培養的細菌按照5%的比例接種于TSB搖瓶中，RA專用液體培養基培養的菌落按照5%的比例接種于RA專用液體培養基搖瓶中，37 ℃搖床上培養，每1 h對每個搖瓶取樣1次，進行OD值的測定和活菌計數。

2.2 菌株篩選

將發酵至OD值（600 nm）達到1.3～1.5的WF201910株和TA201912株血清6型鴨疫里默氏桿菌制備的二級菌種，按照5%的比例接種于RA專用液體培養基5 L發酵罐中，將發酵至OD值（600 nm）達到1.3～1.5的LY202001株血清6型鴨疫里默氏桿菌制備的二級菌種按照5%的比例接種于TSB培養基5 L發酵罐中。調節溶氧為30%～50%，初始轉速為200 RPM，每0.5 h取樣1次，進行OD值的測定和活菌計數。

2.3 規模化發酵罐工藝驗證

取適宜培養基中培養達到最高菌數的篩選菌株，按照5 L發酵罐摸索的發酵參數與收獲終點判定標準，開展500 L發酵罐工藝驗證。將發酵至二級菌種OD值（600 nm）達到1.3～1.5，按照5%的比例接種至500 L發酵罐中，培養體積為350 L，發酵過程中通過調節攪拌轉速和通氣量使溶氧維持在30%～50%，每1 h取樣一次進行OD值測定、活菌計數與純粹檢驗。

2.4攻毒模型的建立

2.4.1 菌種存活率 各菌株活化后接種于TSB培養基37 ℃培養18 h，進行細菌計數和OD值（600 nm）的測定，2～8 ℃保存，24 h后再次進行細菌計數，確定每個菌株2～8 ℃保存24 h細菌的存活率。

2.4.2 預估菌數 正式培養各菌株，確保各菌株收獲的OD值（600 nm）與存活率試驗收獲的OD值（600 nm）相同，然后進行細菌計數，待24 h后細菌計數結果統計后，計算各菌株的預估菌數。預估菌數=計數結果×各菌株存活率

2.4.3 稀釋度 按照預估菌數把各型菌株稀釋為2×1010 CFU/mL、2×109CFU/mL 、2×108 CFU/mL、2×107 CFU/mL 、2×106 CFU/mL、2×105 CFU/mL 6個稀釋度。

2.4.4 攻毒試驗 取25～30日齡血清6型鴨疫里默氏桿菌抗原抗體雙陰性的易感鴨180只，每個菌株每個稀釋度腿部肌肉攻毒0.5 mL，同時10只不接種作為空白對照，在攻毒動物房隔離器內隔離飼養。攻毒后每天觀察試驗動物的精神狀態、采食情況、發病情況，連續觀察7日，期間死亡的試驗動物及時進行解剖，第8天所有試驗動物無論發病與否全部解剖，觀察病理變化情況，同時進行病原分離和生化鑒定。攻毒7日，以10只易感鴨8只發病的最小劑量作為該菌株的發病劑量。攻毒分組和攻毒劑量情況見表1。

3 結果

3.1 培養基篩選

各菌株培養基搖瓶培養結果見表2、表3。

由表2、表3可知，各菌株使用RA專用液體培養基培養和TSB液體培養基培養后進行活菌計數，結果顯示3個菌株生長曲線均出現了TSA平板計數結果顯著高于RA平板細菌計數結果，說明血型6型鴨疫里默氏桿菌更適合于在TSA平板上生長;同時對比同一菌株在不同液體培養基的細菌生長曲線可以看出，WF201910株和TA201912株適宜的增菌液體培養基為商品化的RA培養基，LY202001株適宜的增菌液體培養基為商品化的TSB培養基。各菌株使用適宜培養基5 L發酵罐培養結果見表4。

由表4可以看出，菌株WF201910株在RA液體培養基最高菌數可以達到2.32×1010 CFU/mL，TA201912株在RA液體培養基最高菌數為3.28×1010 CFU/mL，LY202001株在TSB培養基最高菌數可以達到1.95×1010 CFU/mL，表明TA201912株更適合于規模化生產。

3.2 規模化500 L發酵罐參數驗證試驗結果

結果見表5。

由表5可以看出，TA201912株按照5 L發酵罐的工藝參數進行500 L擴大生產，最高菌數可以達到3×1010 CFU/mL以上，說明5 L發酵罐的工藝參數可以用于規模化生產。

3.3 攻毒模型試驗結果

3.3.1 不同菌株攻毒效果比較 3個菌株不同攻毒劑量攻毒結果分別見表6、表7、表8。

由表6、表7、表8不同菌株攻毒效果可以看出，WF201910株按照1×1010 CFU進行攻毒，發病率可達90%;TA201912株按照1×109 CFU進行攻毒，發病率可達90%;LY202001株按照1×109 CFU進行攻毒，發病率可達100%，均符合發病標準。

3.3.2 各菌株發病試驗動物臨床癥狀 各菌株攻毒后發病鴨均出現不同程度的精神不振、行動蹣跚、眼鼻有分泌物流出、排綠色或黃綠色稀薄糞便等的臨床癥狀。

3.3.3 各菌株發病試驗動物剖檢病理變化 取3個菌株攻毒后瀕死鴨解剖，均可見到不同程度的肝周炎，猶如偽膜覆蓋在肝臟表面，或薄或厚，纖維素性漿膜炎，心包膜炎，氣囊渾濁。不同菌株攻毒后試驗動物的剖解病變分別見圖1。

3.3.4 各菌株發病試驗動物病原分離與鑒定

3.3.4.1 細菌形態 無菌操作取發病鴨肝臟進行涂片，經革蘭氏染色鏡檢可見革蘭氏陰性小桿菌;瑞氏染色兩端濃染。

無菌操作取各菌株攻毒發病鴨肝臟組織涂抹接種到TSA（含5%新生牛血清）和麥康凱瓊脂平板，37 ℃二氧化碳培養箱中培養48h后，在TSA平板上均可見呈凸起、邊緣整齊、光滑型菌落;在麥康凱瓊脂平板上均不生長。

3.3.4.2 生化鑒定 取各分離菌株開展生化鑒定試驗，結果顯示葡萄糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇發酵試驗、VP試驗、硫化氫試驗均為陰性，明膠穿刺試驗呈陽性。各分離菌株生化試驗結果見表9。

3.3.4.3 血清型鑒定 取潔凈載玻片，用記號筆在載玻片反面劃分3個區域，每個區域分別滴加經TSA平板分離的細菌液0.01 mL、陰性血清對照和血清6型陽性對照菌株。然后每個區域分別加入等量的血清6型陽性血清（凝集價不低于1：8），各分離菌株玻板凝集試驗結果見表10。

由表10可以看出，各分離菌株均與血清6型陽性血清發生了凝集，證明攻毒后試驗鴨發病的原因是鴨疫里默氏桿菌導致的。

4 討論

4.1 菌株適宜培養基的篩選

從試驗結果可以看出，同樣是血清6型的鴨疫里默氏桿菌，不同菌株適宜的培養基類型不同，WF201910株和TA201912株適宜的增菌液體培養基為商品化的RA培養基，LY202001株適宜的增菌液體培養基為商品化的TSB培養基。但是從細菌計數情況來看，3株細菌在RA專用固體培養增值的效果都不如TSA平板的增值效果，而且在RA專用固體培養基培養的菌落生長速度慢，菌落數量少，所以在接下來的5 L發酵罐小試與中試試驗中均使用TSA平板進行細菌計數。

4.2 適宜于規模化生產的血型6型鴨疫里默氏桿菌篩選

從試驗結果可以看出，各菌株以相同OD值的二級菌種按照5%接菌量在5 L發酵罐培養，WF201910株和TA201912株在RA液體培養基最高菌數分別達到2.32×1010 CFU/mL、3.28×1010 CFU/mL，LY202001株在TSB培養基最高菌數可以達到1.95×1010 CFU/mL，結果顯示TA201912株在RA液體培養基培養是3種菌株中最適合于規模化生產，可以做為血型6型鴨疫里默氏桿菌規模化生產的后備菌株。

4.3 攻毒模型建立

不同地區的3株血清6型鴨疫里默氏桿菌分離株在毒力方面有所差異，LY202001株毒力最強，以109 CFU/羽劑量進行攻毒可使100%的動物發病，且死亡率高達60%;TA201912株毒力次之，以109 CFU/羽劑量進行攻毒可使90%的動物發病;WF201910株毒力最弱，以1010 CFU/羽劑量進行攻毒可使90%的動物發病。從發病情況來看，3株菌株攻毒后基本上是3 d后開始發病，發病與死亡的高峰期在攻毒后3～6 d。通過臨床癥狀、病理學檢查及病原學鑒定，結果顯示3株菌株符合該病模型的復制要求，均可作為血清6型鴨疫里默氏桿菌的攻毒用后備菌株。

參考文獻：

[1] 夏業才，陳光華，丁家波.獸醫生物制品學（第二版）[M].北京：中國農業出版社，2018：893.

[2] SAIF Y M.禽病學[M].北京：中國農業出版社，2012：893.

[3] 任曉梅，王小蘭，韓文龍，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定與生物學特性研究[J].中國動物傳染病學報，2018， 26（3）： 47-51.

[4] 程安春，汪銘書，陳孝躍，等.我國鴨疫里默氏桿菌血清型凋查及新血清型的發現和病原特性 [J].中國獸醫學報，2003，23（4）：320-323.

[5] 張大丙，郭玉璞.不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的部分特性比較[J].中國獸醫雜志，1999，25（10）：13-15.

Establishment of Fermentation Technology and Infected Model of Riemerella anatipestifer Serotype 6

CUI Songqi1，RAO Xiaojun1，ZHAO Haiming1，TIAN Chunli1，YAN Shen1，ZHANG Wenfang1，

ZHANG Danan1，LI E1，LIU Yang1，YU Haitao1，LIU Xinggang1，KONG Min1，GAO Yuehua2，

HU Feng2，HUANG Bing2，LI Yufeng2

（1.Haowei Biotechnology Co. ， Ltd. ，Tianjing? 301700，China;

2.Institute of Poultry Science， Shandong Academy of Agricultural Science， Key Laboratory of Poultry Diseases Diagnosis and Immunology， Jinan? 250100， China）

Abstract： In this experiment， 3 strains serotype 6 of Riemerella anatipestifer （RA） from different geographical locations were isolated. We selected the liquid culture medium and bacterial counting medium by the test of shaking flask， and got the technical parameter through the contrast test of the growth curve of the strains by 5 L fermentation tank of industrial propagation. Disease model were slected through the infected model. The results show that， the optimum fermentation liquid culture medium of WF201910 strains and TA201912 strains were commercial RA culture medium， and the optimum fermentation liquid culture medium of LY202001 strains were commercial TSB culture medium. While bacterial counting culture medium of TSA were suited for all the three strains. Through 5 L fermentation tank the number of TA201912 strains viable bacteria reached a peak 3.28×1010 CFU/mL by using commercial RA culture medium， which technical parameter were also suited by using 500 L fermentation tank in the fermentation process. We administered the RA to 4-week old duckling by muscular injection in the leg， which clinical signs appeared after 3 days， and the peak of morbidity and mortality reached at 3～6 days. Clinical signs and etiological identification were corresponding to the disease caused serotype 6 of RA. This experiment provided preliminary guidance for the inactivated vaccine of serotype 6 of RA.

Keywords：? Riemerella anatipestis; Serotype; Fermentation Technology; Infected Model