蘆柑葉多酚超聲波輔助提取工藝優化及其對亞硝酸鹽的清除活性研究

蘇火煌

(1.漳州職業技術學院應用化工學院，福建 漳州 363000；2.福建省精細化工應用技術協同創新中心，福建 漳州 363000)

蘆柑(CitrusreticulataBlanco cv. Ponkan)，又名柑果，是福建省的優勢果類之一[1-2]。目前，對蘆柑的研究主要集中在果肉、果皮和果核上，而對蘆柑葉研究較少[3-4]。植物的根、莖、葉中一般含有多酚、多糖、黃酮、生物堿等多種具有生物活性的天然成分。陳建福等[3]對蘆柑葉中的總黃酮進行提取，發現總黃酮具有一定的抗氧化活性，是一種天然抗氧化劑。多酚也是一種具有抗自由基、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性的一類天然化合物，在食品、醫藥、化妝品等行業中均有廣泛的應用[5-7]。

肉制品生產過程中常添加亞硝酸鹽，其具有發色和抑菌作用；蔬菜儲存或腌制時，在微生物的作用下也會導致亞硝酸鹽的積累。亞硝酸鹽的清除主要依靠酸解、酶解和還原清除等[8]。研究表明，植物中的一些天然成分能與亞硝酸鹽反應，從而實現消除或降低食物中的亞硝酸含量[9-10]。目前，蘆柑葉多酚提取與清除亞硝酸鹽能力的研究鮮見報道。本文以蘆柑葉為原料，先考察了乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度四個單因素對蘆柑葉多酚提取率的影響，再結合響應面法對提取率工藝條件進行優化，最后考察了蘆柑葉多酚對亞硝酸鹽的清除能力，為蘆柑葉資源開發成一種新型的天然亞硝酸鹽清除劑提供了科學依據。

1 實驗部分

1.1 實驗材料及儀器

蘆柑葉，采摘于福建省南靖縣金山鎮上麻村。將采摘的蘆柑葉用清水清洗，去除泥沙并晾干，置于50℃干燥箱中烘干，粉碎后備用。

乙醇(食品級，河南鑫河陽酒精有限公司)；其它試劑均為分析純。

UV-1100型紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；KQ-100TDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

采用福林-酚法[11]，在10 mL的比色管中加入一定系列體積的沒食子酸標準溶液(100 mg/L)和福林-酚試劑0.5 mL，搖勻靜置1 min，加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液，定容，在設定溫度為75℃的恒溫水浴鍋中保溫反應10 min，反應結束后，靜置冷卻。設置紫外可見分光光度計的吸收波長為765 nm，測反應液的吸光度。以沒食子酸濃度c為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，制作標準曲線。

1.2.2 蘆柑葉多酚的提取及含量測定

設置好實驗所需的工藝條件，稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，加入一定體積和一定體積分數的乙醇溶液，后將圓底燒瓶浸入到設定好溫度的超聲波清洗器中，達到設定的時間后，取出冷卻后過濾，定容，通過標準曲線的測定方法，計算出多酚含量，多酚提取率按下式計算：

其中，T為多酚提取率(mg/g)，b為多酚質量濃度(mg/L)，N為稀釋倍數，V為提取液體積(mL)，m為蘆柑葉質量(g)。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 乙醇濃度的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，分別加入20 mL體積分數為50%、55%、60%、65%、70%的乙醇，在預先設置溫度為60℃的超聲波清洗器中浸提50 min。計算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的乙醇濃度。

1.2.3.2 超聲時間的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，加入20 mL 體積分數為60%的乙醇，在預先設置溫度為60℃的超聲波清洗器中分別浸提40、45、50、55和60 min。計算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的超聲時間。

1.2.3.3 液料比的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，分別加入10、15、20、25和30 mL 體積分數為60%的乙醇，在預先設置溫度為60℃的超聲波清洗器中浸提50 min。計算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的液料比。

1.2.3.4 超聲溫度的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，加入20 mL體積分數為60%的乙醇，分別在預先設置溫度為50、55、60、65和70℃的超聲波清洗器中浸提50 min。計算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的超聲溫度。

1.2.4 響應面優化試驗

在單因素乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、液料比(C)、超聲溫度(D)對多酚提取率影響的基礎上，采用Box-Behnken試驗方法對各單因素進行響應面實驗設計，見表1。

表1 Box-Behnken設計因素與水平表

1.2.5 蘆柑葉總多酚對亞硝酸鹽的清除率

在一系列25 mL的比色管中分別加入10.0 mL pH為3.0的緩沖液(檸檬酸-磷酸氫二鈉)，后分別加入一系列質量濃度的蘆柑葉多酚溶液(或維生素C溶液)，再加入1.0 mL 50 mg/L的NaNO2，并在37℃水浴中保溫1 h，后加入2.0 mL 0.4%(質量分數)的對氨基苯磺酸，靜置5 min后，加入1.0 mL 0.2%(質量分數)的鹽酸萘乙二胺，加蒸餾水定容，靜置15 min后在540 nm處測得吸光度A，空白時的吸光度A0，亞硝酸鹽清除率Q(%)，計算公式如下：

2 結果與討論

2.1 標準曲線

以沒食子酸濃度c為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，得到回歸方程為A= 0.102 3c- 0.029 7,R2=0.999 2。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖1所示，乙醇濃度在60%時達到頂點，繼續增大乙醇濃度，多酚提取率卻開始變小。這是因為水的極性比乙醇大，乙醇濃度的增大，乙醇中的含水量降低，導致乙醇極性降低，提高了蘆柑葉顆粒中一些具有較小極性的多酚類物質的浸出率。然而當乙醇濃度過高時，溶劑的極性過小，導致蘆柑葉顆粒中部分細胞壁上的蛋白質變性，阻礙了多酚類物質的溶出[12]，因此確定最佳乙醇濃度為60%。

圖1 乙醇濃度對多酚提取率的影響

圖2 超聲時間對多酚提取率的影響

2.2.2 超聲時間對蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖2所示，超聲時間由40 min增加到60 min的過程中，蘆柑葉多酚的提取率逐漸增加，并在50 min時達到頂點，繼續增加超聲時間，多酚提取率卻開始變小。這是因為超聲時間較短時，蘆柑葉多酚還不能充分溶出，但超聲時間過長，提取液中部分熱敏性較差的多酚類物質會而發生氧化與破壞[13]，因此確定最佳超聲時間為50 min。

2.2.3 液料比對蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖3所示，液料比由10 mL/g增加到30 mL/g的過程中，蘆柑葉多酚的提取率逐漸增加，并在20 mL/g時達到頂點，繼續增加液料比，多酚提取率卻開始變小。這是因為液料比的增大有利于蘆柑葉顆粒與提取液的充分接觸，使溶出的多酚增加。但當液料比過大時，蘆柑葉顆粒中的蛋白質等雜質成分會與多酚類物質發生溶出競爭[14]，因此確定最佳液料比為20 mL/g。

圖3 液料比對多酚提取率的影響

圖4 超聲溫度對多酚提取率的影響

2.2.4 超聲溫度對蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖4所示，超聲溫度由50℃增加到70℃的過程中，蘆柑葉多酚的提取率逐漸增加，并在60℃時達到最頂點，繼續增加超聲溫度，多酚提取率卻開始變小。這是因為溫度的升高，蘆柑葉顆粒內物質與溶劑的接觸與交換的頻率增加，使得酚的提取率增大[15]，但超聲溫度太高時，多酚中某些熱敏性較差的物質會因為溫度過高而發生氧化，因此確定最佳超聲溫度為60℃。

2.3 響應面優化試驗

2.3.1 響應面設計及結果

根據單因素實驗中各單因素的取值范圍，以多酚提取率為響應值(Y)，結合Box-Behnken實驗設計原理，確定以乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、液料比(C)和超聲溫度(D)4個因素為多酚提取率的影響因素，并設計響應面方案，進行實驗，得到實驗結果及方差分析分別見表2和表3。

表2 響應面分析方案及結果

利用Design-Expert 8.05b軟件對表2中的29個實驗結果進行數據處理，得到多酚提取率(Y)與所考察的四個因素的二次多項回歸模型：

Y=32.10+0.52A+0.27B+0.10C+1.72D-0.13AB+0.27AC+0.50AD+0.09BC-0.51BD-0.14CD-2.47A2-1.62B2-1.26C2-1.76D2.

表3 方差分析結果

方差分析結果見表3。從表3可知，該回歸模型的P<0.000 1，F=10.790，說明響應面優化得到的回歸模型達到了非常顯著的水平；失擬項P=0.093 7>0.05，失擬項不顯著，表明響應面優化得到的回歸方程的殘差均由隨機誤差引起。決定系數R2=0.915 2，表明該回歸方程具有較好的擬合度，有超過91.52%實驗真實值可以利用該回歸模型來描述。回歸方程模型中一次方項D,二次方項A2、B2、C2、D2對蘆柑葉多酚提取率影響均達到了極顯著水平(P<0.01);一次方項A對蘆柑葉多酚提取率影響達到了顯著水平(P<0.05)；剩余的其它項對蘆柑葉多酚提取率影響均不顯著(P>0.05)。由此說明蘆柑葉多酚的各提取因素與蘆柑葉多酚提取率之間的函數關系較為復雜。綜上分析，該回歸模型具有較高的擬合度和較小的誤差，準確率高，可以用于蘆柑葉多酚提取工藝的分析與預測。

2.3.2 響應曲面圖分析

圖5為乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度之間的交互作用對蘆柑葉多酚提取率影響的響應面和等高線圖，通過響應面曲面的斜率和等高線密集度可以直接確定各工藝因素交互作用對蘆柑葉多酚提取率的影響程度，響應面曲面的斜率越大，等高線越密集，表明乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度等因素間的交互作用對蘆柑葉多酚提取率的影響越大，反之則越小。對圖5中的各個響應面和等高線圖進行比較分析，可以發現超聲時間與超聲溫度的響應面曲面斜率最大，等高線最密集，說明乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度四個因素間的交互作用對蘆柑葉多酚提取率的影響最顯著的是超聲時間與超聲溫度，而響應面曲面斜率和等高線最密集程度次之的是乙醇濃度與超聲溫度，說明工藝因素間的交互作用對蘆柑葉多酚提取率的影響程度次之的是乙醇濃度與超聲溫度，同理可得影響蘆柑葉多酚提取率程度的顯著性順序為BD>AD>AC>CD>AB>BC。

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(j)

(k)

(l)

2.3.3 最優工藝條件驗證

根據表2的響應面實驗數據，并利用Design-Expert 8.05b軟件進行分析，確定超聲波輔助提取蘆柑葉多酚的最佳工藝參數為：乙醇濃度60.79%、超聲時間50.00 min、液料比20.14 mL/g和超聲溫度62.55℃，此時通過軟件計算的蘆柑葉多酚提取率的理論值為32.58 mg/g。由于理論的最佳參數，實驗條件設置較為不便，將工藝修正為:乙醇濃度61%、超聲時間50 min、液料比20 mL/g和超聲溫度63℃，并在此工藝下進行三次驗證實驗，得到蘆柑葉多酚的提取率為32.27 mg/g，其與模型預測的理論值相對誤差為0.95%，說明所建的模型方程準確、可靠，可應用于蘆柑葉多酚提取工藝的預測。

2.4 蘆柑葉多酚對亞硝酸鹽的清除率

如圖6所示，隨著維生素C和蘆柑葉多酚質量濃度的增加，兩者對亞硝酸鹽的清除率均逐漸增大，說明在所考察的濃度范圍內，蘆柑葉多酚均能較好地清除亞硝酸鹽，且與亞硝酸鹽的清除率之間存在一定的量效關系，維生素C和蘆柑葉多酚對亞硝酸鹽清除的IC50分別為1.41 mg/L和1.93 mg/L。

圖6 維生素C和多酚對亞硝酸鹽的清除率比較

3 結語

利用天然植物提取物來降解食物中的亞硝酸鹽是一種高效且安全的方法，孫昕等[16]采用酶解法對生姜中的姜辣素進行提取，確定了姜辣素的最佳提取工藝，當提取的姜辣素質量濃度為17.5 mg/mL時，亞硝酸鹽的清除率可達99%以上，其清除能力與1 mg/mL的的抗壞血酸溶液相當。LUO等[17]研究了兩色金雞菊總皂苷的提取工藝，在總皂苷對亞硝酸鹽清除能力和亞硝胺生成的抑制活性的實驗過程中發現,兩色金雞菊總皂苷具有一定的亞硝酸鹽清除能力，并且具有較好的抑制亞硝胺生成的活性。本文以蘆柑葉為原料，考察了乙醇濃度、超聲時間、液料比和超聲溫度四個單因素對蘆柑葉多酚提取率的影響，再結合響應面法對提取工藝條件進行優化，確定了蘆柑葉多酚的最佳提取工藝：乙醇濃度61%，超聲時間50 min，液料比20 mL/g和超聲溫度63℃，得到蘆柑葉多酚的提取率為32.27 mg/g，其與模型預測的理論值相對誤差為0.95%，說明所建的模型方程準確、可靠，可應用于蘆柑葉多酚提取工藝的預測。在所考察的濃度范圍內，蘆柑葉多酚均能較好地清除亞硝酸鹽，且與亞硝酸鹽的清除率之間存在一定的量效關系，蘆柑葉多酚對亞硝酸鹽清除的IC50為1.93 mg/L，為蘆柑葉資源開發成為一種新型的天然亞硝酸鹽清除劑提供了科學依據。