基于核酸適配體檢測食源性致病菌的研究進展

董 蕾，黃利華

（廣州城市職業學院食品科學與美食養生學院，廣東 廣州 510640）

全球食品安全問題以食源性致病菌導致的疾病為問題之首。根據WHO統計顯示，每年全球所發生的食源性疾病可達數10億起。僅因為食物所引起的腹瀉性疾病導致的死亡人數每年就可達220萬人[1]。食源性致病菌通過污染食品，引起人類疾病，常見的致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌（尤以出血性大腸桿菌O157:H7為主）、致病性弧菌、志賀氏菌等。這些致病菌污染食品后，會引起食品腐敗變質或代謝產生毒素，引起人畜患病。

傳統食源性致病菌檢測方法包括平板分離法[2]、分子生物學方法[3-5]、免疫學方法[6]等。但傳統檢測技術檢測周期長、靈敏度不高、技術要求高；分子生物學技術則要求技術條件高、檢測易出現假陽性結果；免疫學檢測方法的前期抗體制備周期長、研發成本高，均不能很好滿足食源性致病菌快速、靈敏、特異的檢測需求[7]。在適配體發現以后，通過適配體與不同技術的結合，使食源性致病菌檢測方法步入新階段。本文主要從核酸適配體的特征以及在不同領域，尤其是食源性致病菌檢驗方面的應用作簡要概述。

1 適配體的特點

1990年，Tuerk等發現一類能夠與蛋白結合，產生高特異性和親和度的單鏈核酸序列，將其定名為適配體（Aptamer）[8]。適配體是一段特異的單鏈DNA或RNA，通過獨特的空間結構，可以實現高特異性識別和高親和性的結合靶物質。由于適配體的靶物質可以為生物分子、化學分子及細胞，且探針具有分子量小、無免疫原性、修飾簡單等優點[9][10]，故自從發現以來，涌現出大量針對不同靶物質的適配體研究，搭載在不同的材料上制成各種生物傳感器，廣泛應用于藥物生產、醫學檢測、活體成像等領域[11]。

適配體通常含有15-40個堿基，分子量為5-25kD。與抗體等傳統免疫檢測原件相比，適配體具有以下幾個特點：

（1）測環境要求不高、易做各種修飾：適配體為一類核酸物質，片段小，性質穩定，因此能夠耐高溫、耐酸堿環境，且由于其片段小，易于保存，不易降解，同時可以在序列末端進行巰基、生物素或其他生物基團的標記，用以搭建各種生物傳感器。

（2）和性高、特異性強：由于適配體是單鏈的寡核苷酸DNA或RNA，可以形成各種空間構象（如發卡結構、口袋結構、G-四聚體等），通過氫鍵、范德華力等作用與相應的靶物質形成穩定的復合物[12]，這一類復合物的穩定契合可以使解離常數達到nmol甚至pmol水平，因此具有高結合能力。

（3）選周期短：傳統免疫學檢測進行抗體篩選，需要經過一系列體外篩選及動物實驗，實驗周期長。但適配體篩選過程不需要進行動物實驗，經由最常見的適配體篩選技術──指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX），經過8-15輪的篩選后，即可得到與靶物質親和度高、特異性強的適配體，整個周期可控制在1-2個月。

（4）用范圍廣：適配體是一段包含15-40個堿基的隨機序列，用于進行適配體篩選的文庫容量巨大，因此靶物質的范圍極廣，包括生物小分子、蛋白質、細胞甚至完整細胞[13-16]。隨著研究者們的不斷深入和廣泛研究，僅以食品檢測為例，適配體現已在農獸藥殘留[17-21]、重金屬[22-24]及食源性致病菌[25][26]等檢測中取得一定成績。

2 核酸適配體的應用

近年來，隨著對適配體研究的不斷深入，適配體已經廣泛應用于基礎研究、生物傳感、治療、微生物檢測、細胞成像分析等相關領域中[27]。

2.1 基礎研究領域

一般的，適配體用于進行生命進化方面的研究。應用SELEX技術可以方便快捷的進行核酸方面的研究。如利用SELEX篩選核酶的特異性寡核苷酸適配體及其剪切位點，用于進行生物傳感材料的集成[28]。通過適配體的生物素標記、熒光素標記等化學修飾，再與蛋白質結合，也可用于蛋白質的細胞定位以及分離純化等基礎研究。

2.2 分析檢測領域

與抗體相比，適配體作為生物傳感器具有可重復利用性的優勢，因此近年來基于適配體的生物分析模式迅猛發展。一般根據信號收集方式不同，可將適配體生物傳感器分為電化學傳感器、光學傳感器和質量敏感傳感器。如Li等人利用適配體修飾金電極表面，從而建立利用電化學信號檢測凝血酶的方法，其檢測限可達到1pmol/L[29]；Song KM等人將適配體吸附于納米金表面，當適配體與目標物質結合后，會從納米金表面脫離，引起納米金在鹽溶液中的聚集，溶液可由紅色變為藍色，從而實現肉眼識別檢測卡那霉素，檢測限可達25nmol/L[30]。

2.3 食品安全檢測領域

食源性致病病菌的檢測是食品安全檢測中占比非常高的一部分，傳統食源性致病菌的檢測存在耗時長、技術要求高、前期研發或檢測成本等弊端，適配體的發現彌補了這些常規技術的不足。一般進行食源性致病菌的靶物質篩選分為全細胞、表面組分以及毒素。已有較多研究對于大腸桿菌[31][32]、沙門氏菌[33-35]、金黃色葡萄球菌[36]、單增李斯特菌[37]等進行了適配體序列的篩選。同時，也有相關報道進行生物毒素的檢測，如Cruz-Aguado&Penner首次篩選赭曲霉毒素A（OTA）特異性適配體，并建立OTA適配體為識別模式的熒光偏振檢測技術[38]。

2.3.1 基于適配體的光學傳感器

熒光適配體生物傳感器利用熒光基團標記核酸適配體，當目標菌與適配體結合，產生熒光偏振或熒光強度的改變，進行食源性致病菌的檢測[39][40]；或將熒光基團或淬滅基團標記在適配體兩端，當目標均與適配體結合后，會引起適配體構象發生改變，引起熒光信號差異[41]。當探針加入納米材料氧化石墨烯后，熒光探針由于吸附在氧化石墨烯上而導致熒光淬滅。當目標菌出現時，適配體與靶物質結合，使熒光信號重新激發，通過對熒光信號的強弱進行測定，可實現鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，其檢出限為102CFU/ml。利用熒光適配體生物傳感器在沙門氏菌O8[42]、單增李斯特菌[43]、金黃色葡萄球菌[44]等均已有很好應用。

2.3.2 基于適配體的電化學傳感器

電化學技術操作簡便、靈敏度高、成本低廉[45]。將適配體與電化學活性傳感原件固定于電極上，當加入靶物質時，適配體與靶物質結合會導致電極表面修飾物結構發生改變，通過檢測電化學信號或電流變化，即可實現目標菌的定性和定量檢測。目前，通過電化學傳感器檢測大腸桿菌O111[46]、大腸桿菌O55:B5[47]、葡萄球菌腸毒素B[48]等食源性致病菌或腸毒素已獲得成功。

2.3.3 基于適配體的壓電晶體傳感器

壓電晶體是一種非中心對稱晶體，在機械力夏可發生形變，帶電質點發生相對位移，使晶體表面出現正、負束縛電荷，兩側的電勢差就可作為檢測信號。Ozalp等將能識別沙門氏菌的適配體修飾石英晶體微天平（QCM）傳感器上，當出現目標菌時，兩者結合會導致QCM傳感器發生形變，引起電勢差，檢出限為100CFU/ml[49]。

3 結語與展望

核酸適配體具有特異性強、穩定性好、靈敏度高、親和力強、易于修飾等特點，能夠識別多種目標物，與納米金、熒光、電化學、流式、表面增強拉曼等技術相結合，可進一步提高檢測的靈敏度，降低檢測成本，縮短檢測時間，因此在食源性致病菌檢測中得到廣泛應用。然而，適配體技術在食源性致病菌檢測相關技術依然存在適配體篩選效率低，高通量與多重同時檢測關鍵技術欠缺，相關儀器設備體型龐大、價格昂貴等瓶頸，難以滿足現場快速檢測需求。在未來的技術發展中，對于核酸適配體的篩選可以考慮基于石墨烯技術、細胞芯片技術或高保真適配體篩選技術，從而提高適配體的篩選效率；同時在檢驗檢測領域，核酸適配體可與環介導等溫擴增技術、重組酶介導等溫擴增技術等相結合，降低檢測食源性致病菌的檢出限。