繼發性淋巴水腫動物模型的研究進展

楊 杏,潘興芳,2,趙天易,趙美丹,2,李忠正,2

(1.天津中醫藥大學實驗針灸學研究中心,天津 301617;2.天津中醫藥大學針灸推拿學院,天津 301617;3.中國中科學院中醫臨床基礎醫學研究所,北京 100700)

繼發性淋巴水腫（secondary lymphedema，SL）是由于癌癥、放射治療、慢性靜脈功能不全、手術、外傷或感染所導致的淋巴系統阻塞或破壞引起的疾病［1-2］。SL的發病原因復雜，發病機制尚未完全明確，因此治療手段局限，無法有效治愈［3］。其中，手術和放射治療是SL最常見的原因。繼發于手術及放射治療的淋巴水腫可能是在淋巴系統損傷后，富含大量蛋白質的淋巴液由于回流受阻滯留于組織間隙，導致組織間隙的膠體滲透壓升高、血管內外滲透壓差減小，使得大量液體從毛細血管進入組織間隙，從而形成高蛋白性水腫。而淋巴液中蛋白質等物質進一步刺激結締組織異常增生，出現膠原沉積，導致皮下組織逐漸纖維化，加重淋巴水腫程度［4-5］。盡管針對SL的研究不斷深入，但該疾病動物模型復雜多樣，缺乏規范性，限制了其病理機制的深入探討。創建穩定的能較好模擬臨床特征的繼發性淋巴水腫動物模型是目前亟待解決的問題。

SL模型最早見于19世紀［6］，是以犬類為模型動物，由于技術條件的限制，多產生急性淋巴水腫，難以形成慢性繼發性淋巴水腫。隨后，研究人員又建立了幾種不同動物的SL模型，包括大鼠、小鼠、兔、猴等。目前，手術與放射技術相結合是建立SL模型較常用的方法，但不同動物的放射劑量和放射時機會有差異，且操作部位常有不同，如嚙齒類動物常用后肢和尾部，兔類動物常用耳朵和后肢部位，犬和猴類常用后肢。

本文從實驗動物種類和造模干預方法兩方面，對2000年至今發表的SL動物模型相關的主要研究進展進行綜述。

1 常用于構建繼發性淋巴水腫模型的動物

1.1 嚙齒類

嚙齒類動物是常用實驗動物。嚙齒類動物與人類基因水平高度同源，其免疫力及對外界環境的適應力強，存活率高［7］，且價格低廉，易繁殖。研究人員常在嚙齒類動物的后肢［8-10］和尾部［11-12］進行造模。也有學者認為，大鼠因淋巴結構分明而常被用于SL實驗，適用于研究人類SL［13］。

1.2 犬

犬的淋巴系統在淋巴管的數量、大小和深淺層次排列分布方面，與人類淋巴系統有著顯著的相似性［14］。犬類動物體型較大，后肢血管和淋巴管口徑較粗，因而其器官與組織方便后期實驗標本的觀察與統計，尤其適用于顯微淋巴外科的應用及研究。目前，多使用犬類四肢進行造模［15］。

1.3 兔

兔的淋巴系統可以分為耳前、下頜下、側頸根、腋窩、腰椎、腹股溝、尾根和腘區這8個區域［16］，每個區域都分布各自的淋巴管和淋巴結。目前，常用兔類在耳部制備SL動物模型。同時，兔也常被用于研究淋巴結移植等方面的相關實驗［17］。

1.4 豬

豬的淋巴系統包含7個淋巴體：腮腺、下頜、頸背、頸腹側、髂下、腹股溝和腘區。由于淺表腋窩區域不存在淋巴結，因此豬不適用于建立乳腺癌相關SL模型［18］。

2 常用的建模方法

在建立SL動物模型過程中有許多不同的造模方式，主要有單純手術、手術與放射技術相結合這兩種方法。目前為止，尚沒有完善的SL動物模型。本文分析已有文獻并總結經驗，以便于之后開展相關研究。

2.1 手術方法

單純通過手術建立SL動物模型的方法主要是破壞淋巴結和淋巴管。下面基于動物種類進行分類敘述（表1）。

表1 通過手術干預建立的常見SL模型Table 1 Common secondary lymphedema model established by surgical intervention

2.1.1 鼠的手術造模方法

鼠類最常用尾部操作。鼠尾部SL模型涉及所有真皮水平初始淋巴管的圓周結扎，手術方法簡便，成模率高。該方法將鼠尾部近端皮膚通過圓周切口切開，并對染色的集合淋巴管進行燒灼以破壞尾部淋巴管，但這種方式可能會導致尾部壞死和早期的尾部腫脹消退［11］。研究證實，鼠尾部術后損傷的淋巴管生長和重塑為SL的生物學研究提供了穩定有效的基礎［19-21］。但是不同于人類肢體，鼠尾大部分是由表皮和軟骨構成［22］，因而鼠尾部SL模型可能與人類肢體淋巴水腫無相似性。這一點限制了其臨床應用轉化。

2.1.2 兔的手術造模方法

使用兔耳構建SL模型也是常用方法。將兔耳全皮膚剝脫和破壞淋巴通道后，約15 d后出現腫脹。這種造模方式耗時短，易復制。兔耳部SL模型是研究淋巴水腫治療新方法的可重復替代方案［23］。

2.1.3 大型動物的手術造模方法

大型動物SL模型與人類疾病模式具有較大的相似性，且淋巴引流系統單一，較為清晰。在這類模型中，清掃四肢淋巴結是誘導淋巴水腫的主要方式。Tobbia等［24］采用綿羊作為實驗對象，通過手術縫合淋巴管，并切除單個腘淋巴結；但是在淋巴結切除后的12～16周，大約有80%的綿羊淋巴功能得以恢復，難以形成慢性SL。這說明單純通過手術的方法切除綿羊腘窩淋巴結后，會出現淋巴管再生的情況，影響模型的制備。Olszewski等［25］通過切除犬后肢上部皮膚、皮下組織、筋膜和股骨骨膜，并橫斷主要的淋巴管來實現淋巴水腫。盡管犬較綿羊切除了更多的組織，但是最終僅有三分之一的犬發生慢性SL。

綜上，雖然通過手術方法進行SL模型制備十分常見，但是研究發現僅通過手術切除淋巴管后制備的動物模型，傷口范圍大、創傷深所導致的炎性反應會使周圍組織釋放促淋巴管新生因子，如血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C），激活干細胞和淋巴管內皮祖細胞，使其分化增殖，進而促進淋巴管新生，這一過程會對SL動物模型的制備產生影響［26］。另外，手術方法的差異性會導致水腫高峰出現時間不一致，且多產生急性SL，難以持續。因此，單純通過手術方法進行造模時需要克服一些關鍵問題，如SL生成的不確定性、高并發癥發生率、缺少誘導淋巴水腫的診斷標準等［27］。

2.2 手術與放射相結合

在臨床中，SL的發生多數是癌癥手術放化療后損傷淋巴系統所致［2］。為了更好地模擬臨床手術與放射治療相結合的情況，淋巴清掃術后聯合放射技術破壞術后殘余淋巴管以抑制淋巴再生和側支循環，這種方法更能構建符合人類SL的狀態。但是這種建模方式不僅需要選擇合適的放射時機，而且需要考慮放射劑量的問題。對此，研究人員進行了一系列實驗，但是不同的動物可以采取的最佳放射劑量仍需要繼續摸索、驗證。

現筆者從動物種類、放射時機及放射劑量等方面進行論述，總結文獻中常見的手術與放射結合SL模型，見表2。

表2 通過手術與放射結合建立的常見SL模型Table 2 Common secondary lymphedema model established by surgery combined with radiation

2.2.1 放射時機

在手術與放射技術相結合的方法中，動物的四肢是最常采用的部位，其中放射的時機和劑量十分重要。在放射時機方面，Das等［28］以犬后肢作為模型基礎，在腹股溝進行結締組織、肌肉筋膜和深部淋巴管切除后，將犬分為兩組，在相同放射劑量的情況下，分別進行術前放射和術后放射。結果顯示，術前放射組在術后4～6周所有存活的犬均發展出SL，并持續至少12個月，而術后放射組結果不甚理想。研究人員認為，術前放射更容易破壞真皮淋巴結，構建的淋巴水腫動物模型更為持久且成功率較高，因此術前放射組優于術后放射組。但也有學者認為，術前放射或術后放射均對SL模型的制備沒有影響。孫一宇等［29］通過調整手術時機，將小鼠隨機分為3組：術前放療組、術后放射組、術前及術后放射組。結果顯示，這3組均成功構建了小鼠后肢SL模型，但以術前及術后放射組效果更優，SL持久，同時小鼠死亡和發生SL并發癥的概率較低。以上三組均選擇術前3 d和術后2周放射，劑量為4.5 Gy。綜上所述，以手術與放射技術相結合的方式建立SL模型時，放射時機上存在爭議，可能術前及術后聯合放射的方式更合適。

2.2.1 放射劑量

在放射劑量方面，根據動物種類的差異性，所適用的放射劑量也不同。

目前采用手術與放射技術相結合的方法制備SL模型時最常用的是嚙齒類動物。有研究者通過實驗研究發現，不同的放射劑量對實驗動物的影響差異性較大。Sommer等［21］嘗試在12只雌性大鼠的后肢誘導SL：手術切除大鼠右后肢的腹股溝淺淋巴結、腘窩淋巴結和鄰近淋巴管，術后7 d在右腹股溝施以單劑量15 Gy的放射，放射后4周處死動物。經過磁共振成像技術觀察水腫程度，除去在磁共振成像采集過程中因擺放位置不可觀察的4只大鼠外，剩余大鼠中有87%成功構建了SL模型。Yang等［30］將雄性大鼠分為4組，在術后分別施以20、30、40 Gy劑量的放射，其中接受20 Gy放射劑量的大鼠建模成功率為81.5%，放射劑量在30～40 Gy的大鼠建模成功率約37%～50%，同時出現嚴重的并發癥和較高的死亡率；通過選擇合適的手術部位并結合適當的放射劑量，其產生的下肢淋巴水腫可以長達4個月。大鼠較為合適的放射劑量約為25～35 Gy，這樣制備的SL動物模型并發癥少，死亡率低，水腫持續時間長。J?rgensen等［31］在研究雄性小鼠后肢SL的實驗中，將小鼠后肢皮膚環狀切開，切除淋巴結并結扎淋巴管，然后分別在術前7 d及術后3 d施以7.5、10、15和30 Gy不同劑量的放射。結果顯示，低劑量放射小鼠在術后出現急性期水腫，但未持續；而較高劑量放射雖可誘發持續的SL，但容易出現并發癥；術前、術后10 Gy組的小鼠在1周后逐漸成功地誘導出SL，并且未出現嚴重的肢端壞死等并發癥。最后建議用小鼠建立SL模型時適合的放射劑量約為4.5～10 Gy。另外，由于制備方式簡便，鼠尾部常用于創建SL動物模型，但是鼠尾部可能不適用于制備慢性SL動物模型。

基于兔類后肢的SL造模相對較少。柴凡等［32］將雄性日本大白兔分為手術組、放射組及聯合組。手術組切除右側腋窩、胸肌外緣及鎖骨下淋巴結，并結扎破壞全部可見淋巴管；放射組取劑量15 Gy的γ射線進行照射；聯合組則是以同樣的手術方式結合術后7 d以相同的劑量放射。最終放射組不能成功構建模型，而手術組建模成功率約75%，聯合組的成功率達100%。侯傳強等［33］應用手術聯合術后一次性大劑量射線照射的方法，于兔后肢做環形切口并切除皮膚、皮下組織達肌肉，清掃腹股溝區淋巴結，鏡下分離與股部血管和神經伴行的深部淋巴管并將兩端結扎，術后3 d給予20 Gy劑量照射手術野。3個月后兔開始出現漸進性的肢體水腫，約5個月形成穩定的兔后肢慢性SL模型。手術聯合術后一次性大劑量放射的造模方式成功率約為83%，但一次性大劑量（20 Gy）放射容易導致肢端壞死等并發癥，因此兔類后肢使用的放射劑量建議在15～20 Gy較合適。另外，在相同劑量的情況下，還應該進一步研究單次放射與分批次放射的效果。

吳國君［34］使用健康雌性獼猴模擬實施人類腋窩淋巴結清掃術。分別于術前2周及術后4周聯合使用放射技術對動物腋窩區域進行放射以破壞殘存的淋巴管，放射劑量為30 Gy，成功誘導獼猴上肢產生SL，并持續存在24個月。雖然獼猴等靈長類動物與人類生理、解剖和遺傳等因素極其相近，但是由于成本較高，目前尚缺少大樣本研究，且使用猴類的SL相關研究較少。

綜上，放射劑量的高低對模型的成功制備十分重要，劑量過高容易導致許多不可預估的并發癥，如肢端壞死等，而劑量過低則達不到抑制淋巴再生和側支循環的效果。在大鼠后肢構建SL模型較為常見，制備方式簡便，技術比較成熟，成功率較高。

3 總結及展望

目前臨床上尚無能治愈SL的有效方法，其治療效果不佳的主要原因是SL發病機制研究不清。建立規范可靠的動物模型可有力地推動疾病發生發展機制的研究。本文從實驗動物種類、造模干預方法等方面對目前已有的SL動物模型進行分析，發現在嚙齒類、犬、兔、豬等常見的實驗動物中，嚙齒類是最常用的動物模型。其中，建立大鼠SL模型常采用手術與放射技術相結合的方法，放射總劑量為25～35 Gy。由于放射干預3 d后，淋巴組織開始損傷，術后2周殘余的淋巴管新生，因此在術前3 d和術后2周進行放射是破壞淋巴系統較佳的放射時機［35］。大鼠后肢SL動物模型的構建成功率高，效果持久且并發癥較少。小鼠常通過手術方法進行尾部環切以建立SL動物模型，但是小鼠尾SL模型與人類淋巴水腫的差異較大，使其應用受到了一定限制。兔類SL模型同樣適用于研究人類淋巴水腫相關性疾病，常采用耳部和四肢進行造模；但由于兔耳部與人類淋巴水腫部位在解剖學上存在差異，因此兔耳部SL模型也具有一定的缺陷。而且兔相較于嚙齒類動物價格昂貴，從經濟效益方面考慮，目前較少使用。另外，依據目前的造模方法分析，單純的手術方法雖然可以成功制備急性SL動物模型，但是需嚴謹分析手術部位及切除部分。而手術與放射技術相結合進行SL建模是目前常用的方法，通過手術破壞淋巴結和淋巴管，聯合放射技術破壞殘余淋巴管，并抑制手術后可能發生的自發性淋巴管再生。然而采用手術及放射技術聯合的方式耗費時間過長，在價格方面也相對昂貴。

目前在制備SL動物模型的過程中，還存在一些缺陷，例如：測量腫脹程度的方法，目前主要是排水法和軟尺測量法，均存在主觀性；關于大鼠后肢SL模型的報告較多，而前肢造模無報告。在臨床上，乳腺癌是造成上肢淋巴水腫的主要原因之一，患者在完成乳腺癌淋巴清掃術和放射治療后，多數患者會出現上肢SL。因此，為了能更好地模擬臨床上肢SL的狀態，筆者認為，建立大鼠前肢SL模型對于乳腺癌相關淋巴水腫的研究可能具有重要價值和意義。

[作者貢獻]

楊杏：提出文章思路，撰寫并修改文章；

潘興芳：對文章思路有重要建議，檢查文章中語句詞匯并最終定稿；

趙天易：文章框架修改，對文章的思路有重要建議；

趙美丹：文章框架及內容修改；

李忠正：參與論文章修改。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。