光化學法與線栓法制作局灶性腦梗死大鼠模型的比較研究

婁惠娟,張紅石,王宇峰,賈 萌,叢德毓,

(1.長春中醫藥大學針灸推拿學院,長春 130117;2.長春中醫藥大學護理學院,長春 130117;3.長春中醫藥大學附屬醫院推拿科,長春 130021;2.長春新產業光電技術有限公司,長春 130103)

腦卒中又稱中風，是全球人類第二大死亡原因，也是導致人體長期殘疾的第一大原因，往往會給社會及患者家庭帶來嚴重的經濟負擔［1］。因此，對于腦卒中發生的分子生物學及病理生理學機制的研究非常必要。其中，腦梗死是腦卒中發生的一個主要原因。為了充分認識腦梗死的病理生理機制，探索藥物和非藥物治療方法，完成實驗研究向臨床治療的轉化，近年來研究工作者在不斷探索制作更加理想的動物模型［2-3］。腦梗死發病機制復雜［4-6］，單一的模型通常無法概括腦梗死的發病機制。因此，研究目的不同，往往選擇不同的模型。在局灶性腦梗死研究中，最常用的模型是嚙齒動物的大腦中動脈線栓模型［7-9］。同時，光化學模型因其梗死部位可聚焦的特點也被廣泛運用［10-11］。盡管此方面的研究較多，但目前尚沒有完全成熟的局灶性腦梗死大鼠模型，并且模型的表型數據也存在較大差異。本實驗對比光化學法不同光照時間和激光強度以及線栓法中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模時不同缺血時間對腦梗死體積及動物行為學的影響，探討不同的模型制作方法導致的腦梗死體積及行為學之間的關系，為同類型研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

64只300～330 g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，SPF級，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司［SCXK（吉）-2018-0007］，飼養在長春中醫藥大學動物中心［SYXK（吉）2018-0014］。飼養期間各組大鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料［由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，SCXK（吉）2015-0005］。飼養環境：晝夜各半循環照明，濕度恒定，溫度控制在22～25℃。所有實驗方案均經長春中醫藥大學動物倫理審查委員會批準（審批號：IACUC 2020348）。

1.2 實驗試劑和儀器

玫瑰紅（Rose bengal，330000-1G）為美國Sigma-Aldrich公司產品；3%戊巴比妥鈉（批號140418）為德國默克生物科技公司產品；青霉素G鉀鹽（P8010-1MU）為北京索萊寶科技有限公司產品。大鼠單臂數字式腦立體定位儀（68003）購自深圳市瑞沃德生命技術有限公司；綠光激光器（MGL-III-532nm-250mW-20040183）購自長春新產業光電技術有限公司；大鼠恒溫加熱墊、微型手持式顱鉆和MCAO線栓（MSRC42B250PK50）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.3 動物分組

將64只大鼠隨機分為A、B、C三大組，9小組。其中A組為假手術組，其中A1組除激光照射外，其他處理同B組；A2組實驗過程同C組，但不將線栓插入；每小組4只大鼠。B組為光化學組，其中B1組以30 mW∕mm2的激光強度照射15 min，B2組以30 mW∕mm2照射30 min，B3組以60 mW∕mm2照射15 min；每小組8只大鼠。C組為大腦MCAO組，其中C1組缺血時間為30 min，C2組缺血時間為60 min，C3組缺血時間為120 min（以上3組缺血后再灌注），C4組為永久性梗死（不進行再灌注）；每小組8只大鼠。

1.4 光化學法模型建立

大鼠稱體質量，按照35 mg∕kg的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀，并放置恒溫加熱墊。沿頭部正中線切開皮膚，暴露顱骨，根據大鼠腦定位圖譜選定運動皮質區，用平頭顱鉆在前囟（Bregma）前1 mm和中線左3 mm處開直徑5 mm的骨窗至硬腦膜。尾靜脈注射1%玫瑰紅（避光條件下臨時配制，4℃下低溫儲存）3 mL∕kg，靜等2 min。其間將激光器光纖準直器固定于骨窗上方5 mm處，調整光斑在骨窗中央位置［12］，然后調整激光器電流及照射時間［13-14］。照射結束后局部用青霉素沖洗，縫合傷口，蘇醒后放回鼠盒。假手術組大鼠同樣進行麻醉，頭部正中線切開暴露顱骨，尾靜脈注射玫瑰紅，但不進行激光照射。

1.5 線栓法MCAO模型建立

大鼠稱體質量，按照35 mg∕kg的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉后將大鼠放置于恒溫加熱墊上。仰臥位固定，頸正中線進行切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。結扎頸外動脈近心端，夾閉頸總動脈和頸內動脈。在距頸總動脈分叉部5 mm處剪一個小口，通過左側頸總動脈引入直徑為0.38 mm的硅涂層螺紋，通過頸內動脈向大腦中動脈插入18 mm左右，局部用青霉素沖洗，縫合頸正中線切口，注意線栓尾部留在皮膚外［15-16］。計時，缺血時間分別為30、60和120 min，達到時間后線栓輕輕拉出，形成再灌注。假手術組大鼠麻醉后，頸部正中切開，分離血管，但不進行線栓插入操作，縫合皮膚。

1.6 Longa神經功能評分

腦缺血再灌注24 h后，評估人員按照Longa神經功能評分法［17-18］對大鼠進行評分。由3名評估人員采用單盲法進行評分并記錄，取3人評分的平均值作為得分。0分，沒有神經功能缺損；1分，提尾時前肢屈曲；2分，行走時大鼠向一側轉圈；3分，行走時大鼠身體向一側（癱瘓側）傾倒；4分，意識喪失，不能自行行走。

1.7 平衡木行走實驗

腦缺血再灌注24 h后，采用平衡木行走實驗［19］測定大鼠的運動整合及協調能力。平衡木長80 cm，寬2.5 cm，平放在距離地面高10 cm處。由3名評估人員采用單盲法進行評分并記錄，取3人評分的平均值作為得分。評分標準分6個等級。0分：穿過平衡木，不會跌倒。1分：穿過平衡木，跌倒機會少于50%。2分：穿過平衡木，跌倒機會大于50%。3分：能穿過平衡木，但受累的癱瘓側后肢不能幫助向前移動。4分：不能穿過平衡木，但可坐在上面。5分：將大鼠放在平衡木上會掉下來。

1.8 TTC染色法測定梗死體積

大鼠完成行為學實驗后，立即麻醉并迅速將其斷頭處死。取完整的大腦，標明組別及編號，放于－20℃冰箱中冷凍15～20 min至大腦稍微變硬。去除嗅球和小腦，然后使用不銹鋼腦切片模具把腦組織每隔2 mm切一片，均勻切成4～5個層面。將腦組織切片置于裝有2%TTC溶液的6孔板中，37℃恒溫箱中避光孵育20 min，其間不時翻動腦使其均勻接觸到染色液［20］。染色完成后拍照，采用Image J圖像處理軟件計算梗死灶體積。首先計算每個層面腦片的梗死體積，再將各腦片梗死體積之和乘以厚度（2 mm）即為總的梗死體積。梗死體積占比百分比=梗死體積∕全腦體積×100%。

1.9 統計學分析

所有數據均使用GraphPad Prism 8軟件分析制圖。多組之間比較先進行單因素方差分析，有統計學意義時再用LSD-t檢驗進行組內兩兩比較。每個樣本重復檢測3次，計量資料以±s表示。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠基本情況及神經系統評分

MCAO造模腦缺血再灌注24 h后，C3組大鼠死亡2只，C4組死亡3只；其余組無大鼠死亡。各模型組大鼠精神萎靡，活動及攝食減少。Longa神經功能評分結果（圖1A）顯示，術后24 h，A組未見神經系統功能缺失，B、C組出現不同程度的分值升高，與A組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；B1、B2和B3組的評分（分別為1.125±0.641、1.250±0.463、1.375±0.518）之間無明顯差異；C1組和C2組（分別為0.750±0.707、1.250±0.770）之間，以及C3和C4組（分別為2.429±0.535、2.833±0.753）之間也均無明顯差異；而C1、C2組和C3、C4組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 平衡木行走實驗得分

術后24 h，各組大鼠的平衡木行走實驗評分結果（圖1B）顯示，B、C組大鼠與A組大鼠評分具有明顯差異，其中B1、B2、B3組大鼠評分（分別為1.250±0.707、1.375±0.518、1.375±0.744）之間未見明顯差異；C1和C2組（分別為0.750±0.707、1.875±1.126）之間，以及C2和C3組之間均存在明顯差異（P＜0.05），而C3與C4組（分別為3.000±0.817、3.167±0.753）之間未見明顯差異。

圖1 各組大鼠的神經功能評分（A）和平衡木行走實驗評分（B）Figure 1 Neurofunctional score（A）and balance beam score（B）of rats in different groups

2.3 TTC染色梗死體積

TTC染色后未梗死區為紅色，梗死區白色，腦組織中部分部位不能著色（不屬于梗死灶）。染色結果（圖2）顯示，A組大鼠腦組織紅染；B、C組大鼠均形成梗死灶，局部腦組織蒼白、腫脹明顯，其中B組大鼠梗死腦組織冠狀面呈“碗型”［21］。統計分析結果提示，A組未見梗死區域；B1、B2、B3各組大鼠的梗死體積平均占比分別為1.35%、5.05%、13.02%；C1、C2、C3、C4各組大鼠的梗死體積平均占比分別為4.55%、14.92%、25.76%、26.42%。B、C組與A組梗死體積相比具有明顯差異（P＜0.01）。除C3與C4組間未見明顯差異外，其他各組之間梗死體積存在明顯差異。

圖2 光化學法和MCAO法建模的各組TTC染色及定量結果Figure 2 TTCstaining and quantitative results of each group modeled by photochemistry method and MCAOmethod

3 討論

研究表明，臨床中多數缺血性腦卒中是由于MCA區域閉塞導致［22］。因此，Koizumi等［23］首次使用4-0尼龍單絲、硅樹脂涂層縫合線建立了MCAO模型，該模型被廣泛應用于MCAO實驗研究。同時，不同線栓制作方法和不同缺血持續時間對MCAO模型的影響相繼被研究。另一方面，Watson等［24］改進了光化學方法并成功誘導了腦梗死動物模型。這種模型的優點是可通過調控不同手術參數來得到不同大小的梗死，并可定位到大腦皮層的不同功能分區。此模型對動物的手術操作簡單，成模率和成活率高［25］；但是因為手術操作的可調控參數多，需要多組預實驗才能取得預期效果。

本研究中，兩種模型制作方法均得到了體積及嚴重程度不等的梗死灶。實驗B1組和B2組相比，在激光照射強度相同的情況下，光照時間長短與梗死灶表面嚴重程度相關，隨著時間延長終末動脈梗死逐漸嚴重，最終形成不可逆損傷；B1組與B3組相比，設置相同的光照時間，隨著激光強度的增加梗死灶深度可加深，甚至達到皮層以下而影響紋狀體和海馬等部位。光照參數穩定的情況下，梗死體積相對能夠很快穩定，而且動物行為異常與皮層梗死的位置具有良好的相關性，但與梗死體積之間的相關性相對較差。本研究中兩種方法均對大鼠的運動皮層造成了損傷，結果顯示各組術后大鼠的平衡木實驗評分值均升高，且在不同實驗參數下，各組的梗死體積有所變化，而神經功能評分和行為學評分卻未見顯著差異。

C1、C2、C3組MCAO法建立的腦梗死模型中，總梗死體積以閉塞時間依賴性的方式增加；再灌注24 h后取材情況下，缺血120 min形成的梗死灶與永久性梗死灶的體積未見明顯差異，腦缺血面積可達到全腦的26%，缺血部位可涉及半腦大部分皮質、紋狀體、丘腦、海馬和腦室下帶；且MCAO模型的神經功能評分及平衡木實驗評分與梗死體積有良好的相關性。

本實驗研究利用光化學法和線栓法兩種方法建立局灶性腦梗死大鼠模型，比較了行為學評分和TTC染色的組織病理情況，認為線栓法建立的動物模型行為結果與梗死體積大小密切相關，不同程度的梗死體積及行為學異常取決于腦組織缺血時間。因此，通過行為學的觀測來預測梗死體積的變化，對于模型的篩選及治療周期的確立更加便捷有效。相較而言，光化學法建立的動物模型產生特定部位的病變和特定的行為變化，行為學結果與梗死體積的相關性差。光化學模型由于病灶屬于終末動脈的梗阻，不可逆并嚴重導致對神經保護措施不敏感，因此對于遠期的運動感覺異常行為觀察而言，光化學模型相對穩定。本研究主要探討梗死灶與大鼠運動能力之間的關系，未來研究將進一步細化探討不同的腦梗死體積及位置對大鼠運動障礙、感覺障礙和認知障礙等行為學的影響，為滿足不同研究方向所需模型制作提供參考。

[作者貢獻]

婁惠娟：設計并完成實驗，撰寫文章；

張紅石：實驗數據分析；

王宇峰：參與設計實驗，把關實驗操作，提供實驗資金。

賈萌：光化學造模條件及激光器使用指導，參與實驗參數設定。

叢德毓：提出并指導設計方案，審核及修改文章。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。