國產豬小腸黏膜下層脫細胞基質用于兔硬腦膜修復的效果及安全性

孫立旦,楊飛霞,張 迪,陳澤良,張志慧,李英俊,史利軍

(1.沈陽農業大學動物科學與醫學學院,沈陽 110866;2.北京通和立泰生物科技有限公司,北京 102609;3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

豬小腸黏膜下層脫細胞基質補片是采用豬小腸黏膜下層組織為原料，經過病毒滅活、脫細胞、成型、凍干等工藝制備的天然衍生生物材料，是一種非交聯型動物源性細胞外基質材料［1］。大量臨床和基礎研究顯示，小腸黏膜下層含有膠原蛋白、彈性蛋白、黏多糖、蛋白多糖和生長因子，在損傷愈合中起著重要作用，可顯著治愈難以愈合或慢性傷口［2］。小腸黏膜下層脫細胞基質材料具有天然特有的細胞外基質結構和組成，能夠主動誘導組織再生，并具有良好的生物相容性、生物力學強度和低免疫原性，在體內可完全降解，有良好的抗感染能力，可用于多種軟組織缺損的修復。

目前，非交聯型小腸黏膜下層脫細胞基質補片材料產品已廣泛用于燒傷、慢性傷口、肛瘺、腹壁疝修復、硬腦膜修復等臨床領域［3］，但是脫細胞不徹底會造成免疫排斥反應的發生，不同廠家生產的補片在工藝和材料成分上存在一定差異，故需要通過動物試驗來驗證和評價。本研究采用新西蘭白兔模型，通過前瞻性隨機對照動物實驗評價國產豬小腸黏膜下層脫細胞基質材料在硬腦膜修復中的安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

48只普通級新西蘭白兔，體質量（2.5±0.25）kg，購自北京隆安實驗動物養殖中心［SCXK（京）2019-0006］。動物飼養于北京通和立泰生物科技有限公司［SYXK（京）2019-0016］，用標準化兔籠單籠飼養，每只每天分兩次飼喂其體質量5%的飼料（北京科奧協力飼料有限公司生產），自由飲水。所有動物實驗操作均符合北京通和立泰生物科技有限公司動物實驗倫理審查委員會審批要求（IACUC 2019021）。

1.1.2 主要材料與試劑

供試品名稱為脫細胞豬小腸黏膜下層基質（供試品號為AN2019021），為北京博輝瑞進生物科技有限公司贈送，批號為20181202，規格為7 cm×10 cm。對照品名稱為生物硬腦膜修補片購自美國Cook Biotech Incorporated公司，批號為LB838536，規格為4 cm×7 cm。3%戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司（批號P3761，規格25 g，CAS編號57-33-0）；陸眠寧Ⅱ購自吉林省華牧動物保健品有限公司（批號P20150402）；氯化鉀購自黑龍江省北安市飛龍動物藥廠（批號20181208）；氨芐西林（批號180701）、慶大霉素（批號180605）和青霉素（批號180401）均購自華北制藥集團動物保健品有限責任公司；蘇木精染液（批號ZL-I9610）購自北京中衫金橋生物技術有限公司，伊紅染液（水溶）（批號71014544）購自中國國藥集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與研究節點

48只新西蘭白兔，隨機分成2組，每組24只，分設供試品（脫細胞豬小腸黏膜下層基質）試驗組和對照品（生物硬腦膜修補片）對照組。分組后每只動物指定一個單一的動物號，動物及籠卡上標明動物號；并且用不同顏色籠卡進行組別區分，并注明實驗編號、供試品名稱、劑量、組別、性別、動物數等指標。研究設4個時間節點，分別為植入術后7 d、30 d、60 d、90 d，每組每個時間點6只動物。

1.2.2 動物術前麻醉

動物術前12 h禁食但不禁水。動物稱體質量后，先用3%戊巴比妥鈉以0.5 mL∕kg劑量靜脈注射，進行誘導麻醉。3 min后靜脈注射陸眠寧Ⅱ，劑量為0.1 mL∕kg。手術過程中視動物麻醉深度，多次追加首次劑量1∕4的陸眠寧Ⅱ。術前于心臟采血2 mL，用于血細胞五分類分析（儀器購自深圳市普康電子有限公司，PE7600）和血清生化分析（儀器購自珠海森龍生物科技有限公司，SL300B）。術前一次性肌內注射氨芐西林2×105U和慶大霉素4×104U以抗感染。

1.2.3 補片植入

實驗方法參照文獻［4-7］，并根據臨床實際情況制定。兔頭固定于頭架上，嚴格執行備皮消毒等無菌準備后，于顱頂正中處取縱行切口，長約5 cm。依次切開皮膚及皮下組織，鉗夾止血；用無菌記號筆在顱頂正中畫一切口約2 cm的正方形；然后用超聲骨刀沿切口外緣切開顱骨，盡可能保留顱骨完整；取下顱骨骨窗，充分暴露硬腦膜；用腦膜剪在骨窗內剪出1.0 cm×1.0 cm大小的圓形硬腦膜缺損，操作時切勿損傷腦組織。將試驗組或對照組硬腦膜補片修剪為相應形狀，貼附于腦表面，硬腦膜補片與缺損處邊緣重疊約0.3 cm，用醫用組織膠（購自北京康派特醫療器械有限公司）固定。植入完成后將顱骨骨窗放回原位固定，縫合皮膚及皮下組織，紗布包扎傷口。手術結束后普通飲食飼養，未給予止痛藥物；術后1～3 d，肌內注射青霉素20×105U∕次，1次∕d，以抗感染。

1.2.4 術后動物情況觀察

植入術后，觀察動物基本情況，包括手術期死亡情況、傷口感染（手術部位有無膿腫，傷口愈合是否良好）、運動障礙（四肢行為是否正常，動作是否遲緩，是否有癱瘓）、精神異常（是否消瘦、呆立）、腦脊液滲漏（腦脊液有無滲出）。

1.2.5 血液學及血清生化指標檢測

術前及術后7 d、30 d、60 d、90 d（安樂死之前），分別采集兩組兔的耳靜脈血，用全自動血細胞分析儀和全自動生化分析儀分別進行血細胞五分類分析和血清生化檢測。

1.2.6 術后安樂死及大體解剖

術后分別在7 d、30 d、60 d、90 d時對2組動物各6只進行安樂死：按動物體質量，先肌內注射劑量為3 mg∕kg的速眠新，再耳緣靜脈注射劑量為0.4 mL∕kg的10%氯化鉀溶液。然后解剖手術部位：用超聲骨刀沿手術部位外緣切開，取顱骨、硬腦膜和腦組織為一體的長約3 cm的正方形標本；獲得標本后，觀察標本橫切面大體外觀，包括手術部位創面愈合情況、補片降解情況、與腦組織粘連情況、是否發生腦水腫、是否發生腦出血、植入后補片位置穩定性、植入物吸收并被新生組織替代和組織長入情況等。

1.2.7 組織病理學觀察

獲取的顱骨、硬腦膜和腦組織標本通過蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察比較兩組的手術周圍組織反應情況，評價內容包括粘連情況、纖維增生情況、血管密度和材料降解情況等。

1.2.8 統計學分析

2 結果

2.1 術后動物基本情況

實驗期內2組動物均無意外死亡。供試品試驗組未見切口感染；對照品對照組有1例發生切口感染，經換藥治療后轉歸。剩余動物均于術后1～3 d恢復正常采食和飲水。兩組均未發生運動障礙、癲癇、腦脊液滲漏、精神異常及發熱等現象。

2.2 術后局部愈合情況

術后7 d，試驗組和對照組動物頭皮均愈合良好，無膿腫、無皮下積液。解剖后發現：兩組動物植入的硬腦膜補片均與周邊硬腦膜形態連續，能完整封閉硬腦膜缺損，無腦脊液漏出，可辨認出補片邊界；補片與腦組織可分離，與大腦表面無粘連；腦組織局部均無受壓、充血和水腫，局部無膿腫及滲出（圖1A1、1A2）。

術后30 d，兩組動物解剖可見顱骨瓣與頭骨之間的縫隙已經被纖維瘢痕組織所替代，兩組補片均出現部分降解，與周邊硬腦膜融合長入，補片與大腦表面均無粘連；各腦隙均無積液（圖1B1、1B2）。

術后60 d，兩組補片均大部分降解，補片邊緣與周邊硬腦膜不能辨別，創面無粘連；硬腦膜下各腦隙未見異常（圖1C1、1C2）。

術后90 d，兩組硬腦膜及腦組織的解剖形態已完全修復，均未發現明顯異常（圖1D1、1D2）。

圖1 不同時間點的兔硬腦膜修復情況Figure 1 Rabbit dura mater repair process at the indicated time points

2.3 血液學指標

試驗組和對照組相比，術前及術后7 d、30 d、60 d和90 d的白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板數量差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組兔不同時間點血液學常規指標比較Table 1 Routine blood parameters in the two groups of rabbits at the indicated time point（±s,n=6）

表1 兩組兔不同時間點血液學常規指標比較Table 1 Routine blood parameters in the two groups of rabbits at the indicated time point（±s,n=6）

注：試驗組植入供試品（國產的脫細胞豬小腸黏膜下層基質材料），對照組植入對照品（購自美國Cook Biotech Incorporated公司的生物硬腦膜修補片）。各時間點兩組間比較均P〉0.05。

指標白細胞計數/（109·L-1）淋巴細胞數/（109·L-1）紅細胞計數/（1012·L-1）血紅蛋白濃度/（g·L-1）血小板數/（109·L-1）組別試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組時間點術前9.6±0.9 9.5±0.9 3.8±0.4 3.6±0.4 6.4±0.7 6.3±0.7 120.0±14.3 122.0±13.2 349.0±31.2 354.0±27.3術后7 d 10.4±0.7 10.5±0.8 3.7±0.4 3.7±0.4 6.3±0.8 6.3±0.7 122.0±15.4 122.0±12.6 350.0±30.6 348.0±30.7術后30 d 9.8±0.5 9.7±0.5 3.7±0.5 3.7±0.4 6.3±0.6 6.3±0.8 123.0±12.7 123.0±20.4 348.0±29.5 351.0±27.4術后60 d 9.6±1.1 9.8±0.9 3.8±0.3 3.8±0.4 6.4±0.3 6.4±0.6 123.0±11.6 125.0±12.0 352.0±34.1 355.0±29.8術后90 d 10.0±0.9 9.9±0.7 3.8±0.3 3.9±0.2 6.4±0.5 6.4±0.8 125.0±9.7 125.0±14.7 353.0±30.6 353.0±35.6

2.4 血液生化指標

試驗組和對照組相比，在術前、術后7 d、術后30 d、術后60 d和術后90 d的谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨?；D移酶、血清球蛋白、血清白蛋白、尿素氮和肌酸激酶含量差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 兩組兔不同時間點的血液生化指標Table 2 Blood biochemical indicators in the two groups of rabbits at the indicated time points（±s,n=6）

表2 兩組兔不同時間點的血液生化指標Table 2 Blood biochemical indicators in the two groups of rabbits at the indicated time points（±s,n=6）

注：試驗組植入供試品（國產的脫細胞豬小腸黏膜下層基質材料），對照組植入對照品（購自美國Cook Biotech Incorporated公司的生物硬腦膜修補片）。各時間點兩組間比較均P〉0.05。

生化指標谷丙轉氨酶ρ/（U·L-1）堿性磷酸酶ρ/（U·L-1）γ-谷氨?；D移酶ρ/（U·L-1）血清白蛋白c/（g·L-1）血清球蛋白c/（g·L-1）尿素氮c/（mmol·L-1）肌酸激酶ρ/（U·L-1）組別試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組時間點術前41.7±5.9 42.0±5.8 68.2±4.3 68.1±3.8 3.8±0.6 3.8±0.6 40.6±5.8 40.6±3.8 30.1±2.5 30.0±2.1 13.2±1.2 13.2±1.3 146.0±11.4 146.0±15.2術后7 d 41.7±2.7 41.9±4.2 68.8±4.0 69.0±4.2 69.2±3.2 3.8±0.3 40.8±4.4 40.7±3.8 30.1±1.8 30.3±1.6 13.2±0.9 13.2±1.5 145.0±11.2 144.0±11.3術后30 d 41.9±2.6 41.9±3.4 68.8±3.8 69.2±3.2 69.5±3.9 3.8±0.7 40.9±2.3 40.9±4.3 30.4±1.3 30.2±2.1 13.2±1.3 13.3±1.1 145.0±11.5 145.0±11.5術后60 d 41.7±3.0 41.7±3.9 69.3±3.4 69.5±3.9 69.7±3.5 3.8±0.9 40.6±4.4 40.8±6.1 30.2±2.6 30.1±3.1 13.2±1.0 13.2±1.0 145.0±9.6 144.0±11.7術后90 d 41.8±2.9 41.9±3.5 69.7±3.5 69.7±3.5 6.4±0.5 3.9±0.4 41.0±2.6 40.9±3.5 30.4±2.7 30.5±2.4 13.3±1.0 13.3±1.3 145.0±15.3 145.0±11.6

2.5 病理組織學檢測

術后7 d，試驗組和對照組兔腦組織在光學顯微鏡下尚可辨認出補片邊緣，補片內部可見淋巴細胞和單核細胞浸潤，表現出輕微的炎性反應；腦室區和腦實質內組織結構正常，均未見明顯炎性細胞浸潤，與補片均未見明顯粘連；補片表層可見成纖維細胞增生，并可觀察到新生血管（圖2A1、2A2）。

術后30 d，試驗組和對照組兔腦組織在鏡下均不能辨認出補片邊緣，補片與硬腦膜組織完全融合，偶見淋巴細胞，補片內部結構松散，可見纖維碎片，提示補片已被宿主細胞降解；“碎片”之間可見較多成纖維細胞，也可見新生血管；補片內側面可見內皮細胞覆蓋，局部腦組織正常，蛛網膜正常（圖2B1、2B2）。

術后60 d，試驗組和對照組補片內部均未見炎性細胞，補片內部成纖維細胞密度增高，新生膠原纖維排列規則，新生血管密度增加，未見明顯瘢痕組織；硬膜內側面內皮細胞密度增高，排列規則（圖2C1、2C2）。

術后90 d，試驗組和對照組硬膜內側面均可觀察到完整內皮，補片均完全降解，可觀察到厚壁成熟血管，膠原纖維排列規則，蛛網膜邊界清晰，腦實質結構正常（圖2D1、2D2）。

圖2 兩組術后各時間點兔腦植入部位的HE染色組織學變化（×100）Figure 2 Histological changes in the implant region of rabbit brain following hematoxylin-eosin staining at the indicated time points after surgery（×100）

3 討論

小腸黏膜下層基質是無細胞的來源于豬小腸的一種基質材料，可以為新生細胞和血管的生長提供附著和支撐功能［8］。研究表明，小腸黏膜下層基質材料在與宿主作用后可逐漸成為宿主組織的一部分［9］。本研究中采用的是具有自主知識產權的非交聯型豬小腸黏膜下層脫細胞基質材料，該材料具有良好的生物相容性，DNA殘留量和α-半乳糖基抗原（α-Gal抗原）殘留低，并具有良好的力學性能。

研究結果顯示，試驗樣品能夠主動誘導成纖維細胞增生、分化，促進新生血管生成，形成排列規則、致密的纖維層，并誘導內皮細胞增殖，形成完整的內皮層，不影響蛛網膜下腔的完整性，在植入90 d時實現了硬腦膜的結構和功能修復。在上述修復過程中，國產試驗樣品與國外對照樣品的效果之間無明顯差異。組織病理學結果顯示，兩組樣品植入后7 d可觀察到補片內部存在炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，補片周圍組織無明顯炎性反應表現，植入后30 d炎性細胞浸潤基本消失。

本研究表明，植入初期的炎性細胞浸潤可趨化成纖維細胞、血管內皮細胞長入，并與材料降解密切相關。血常規及血液生化檢測結果顯示，植入后3 d出現輕度炎性反應，術后1周即明顯減輕，考慮與手術創傷應激有關。小腸黏膜下層基質植入體內可能會引起以Th2淋巴細胞增加為主的一過性免疫反應，Th2淋巴細胞不激活巨噬細胞，產生的IgG不引起補體反應，因此不會引起顯著免疫排斥反應［10］。本研究中HE染色病理組織學檢測結果顯示：兩組樣品植入后7 d即出現成纖維細胞增生，并可觀察到補片纖維碎片，提示在植入早期即同時啟動了降解過程和修復過程；植入后30 d，可觀察到規則致密的纖維層和松散的補片纖維同時存在；術后90 d時可觀察到補片完全降解，代之以完整連續的硬膜結構。總之，通過本研究試驗結果可以證明，國產的豬小腸黏膜下層脫細胞基質材料是一種促進硬腦膜損傷愈合的理想補片材料，使用局部愈合良好，無紅腫、滲出等炎性反應的發生，生物相容性良好，可逐漸降解，動物試驗證明安全、有效，未來有望用于國內硬腦膜缺損的治療。

[作者貢獻]

孫立旦：設計實驗，實施研究，采集并分析數據，撰寫文章；

楊飛霞：實施研究，采集并分析數據，文章內容補充與整理；

張迪：實施研究，采集數據；

陳澤良：實驗指導，技術支持；

張志慧：實施研究，數據統計分析；

李英俊：實驗設計及指導；

史利軍：實驗指導，經費獲取。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。?