不同劑量舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪對(duì)C57BL/6J小鼠的麻醉效果觀察

王成稷,柴 青,龔 慧,王 玨,萬(wàn)穎寒,顧正頁(yè),暴 旭,沈如凌

(1.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,上海 201203;2.青島市疾病預(yù)防控制中心,青島 266011;3.蘇州坤宸生物科技有限公司,蘇州 215031)

舒泰是一種復(fù)合麻醉劑，被廣泛應(yīng)用于寵物及野生動(dòng)物的麻醉，如：犬、貓、穿山甲、大食蟻獸、野豬、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物等［1-7］。但在小鼠麻醉中，單用舒泰的麻醉效果較差，使用劑量低于75 mg∕kg時(shí)小鼠麻醉深度不夠，使用劑量大于75 mg∕kg時(shí)極易造成小鼠死亡；而使用鎮(zhèn)靜劑右美托咪定聯(lián)合舒泰麻醉小鼠可得到較好的麻醉效果［8］。然而右美托咪定價(jià)格比較昂貴，麻醉成本較高。另外，同為鎮(zhèn)靜劑的鹽酸賽拉嗪或鹽酸氯丙嗪等常與舒泰聯(lián)用，應(yīng)用于梅花鹿、馬鹿、旋角羚、斑馬和貓等動(dòng)物的麻醉［9-11］，可有效減少麻醉藥的用量，擴(kuò)大安全范圍［12-13］。本研究團(tuán)隊(duì)嘗試使用不同劑量的舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉C57BL∕6J小鼠，觀察小鼠在不同麻醉劑量下的麻醉時(shí)間，以期為各類小鼠手術(shù)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL∕6J小鼠100只，雌雄各半，7～8周齡，體質(zhì)量（25±3）g，購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司［SCXK（滬）2017-0010］，質(zhì)量合格證編號(hào)20170010016601。小鼠飼養(yǎng)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心屏障設(shè)施［SYXK（滬）2019-0003］。所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)審批通過(guò)（IACUC編號(hào)200511005）。

1.2 主要試劑和儀器

舒泰50（即注射用鹽酸替來(lái)他明鹽酸唑拉西泮）購(gòu)自法國(guó)維克有限公司（批號(hào)7LR9A）；鹽酸賽拉嗪注射液購(gòu)自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司（批號(hào)191019）；新樂(lè)敦滴眼液購(gòu)自曼秀雷敦（中國(guó)）藥業(yè)有限公司（批號(hào)19J061）；生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）購(gòu)自江西科倫藥業(yè)有限公司（批號(hào)C8111301）；加熱墊購(gòu)自余姚高上環(huán)保科技有限公司（型號(hào)DK540270-22X-NZD）；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本日立公司（型號(hào)7080）。

1.3 動(dòng)物分組及麻醉步驟

100只C57BL∕6J小鼠雌雄各半，隨機(jī)分成5組，每組20只且雌雄各半。根據(jù)參考文獻(xiàn)［8］、預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及供應(yīng)商提供的參考劑量，選取舒泰劑量范圍為55～85 mg∕kg，鹽酸賽拉嗪劑量＜30 mg∕kg。首先使用生理鹽水將50 mg∕mL的舒泰和50 mg∕mL的鹽酸賽拉嗪分別稀釋至5 mg∕mL，并將舒泰和鹽酸賽拉嗪以體積比為4∶1混合待用。然后每只小鼠注射前稱體質(zhì)量，分4組給藥，即分別按照舒泰55 mg∕kg、65 mg∕kg、75 mg∕kg和85 mg∕kg（相應(yīng)地，鹽酸賽拉嗪13.75 mg∕kg、16.25 mg∕kg、18.75 mg∕kg和21.25 mg∕kg）的 用藥劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。待小鼠翻正反射消失后，于小鼠雙眼各滴注新樂(lè)敦滴眼液1滴（約20μL）以保護(hù)角膜，放置于保溫墊上，觀察記錄小鼠麻醉誘導(dǎo)時(shí)間、麻醉維持時(shí)間、麻醉恢復(fù)時(shí)間。對(duì)照組小鼠腹腔注射200 μL生理鹽水。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

麻醉誘導(dǎo)時(shí)間指藥物注射入小鼠體內(nèi)到小鼠倒下并喪失痛覺的時(shí)間。麻醉維持時(shí)間指小鼠痛覺喪失到小鼠痛覺恢復(fù)的時(shí)間。麻醉恢復(fù)時(shí)間指小鼠痛覺恢復(fù)到小鼠自行翻正的時(shí)間。總麻醉時(shí)間=麻醉誘導(dǎo)時(shí)間+麻醉維持時(shí)間+麻醉恢復(fù)時(shí)間。痛覺喪失的判定標(biāo)準(zhǔn)：小鼠全身肌肉松弛，呼吸平順，使用食指和拇指按壓小鼠后肢足趾末端，小鼠無(wú)疼痛反應(yīng)。痛覺恢復(fù)的判定標(biāo)準(zhǔn)：小鼠呼吸速度加快，使用食指和拇指按壓小鼠后肢足趾末端，小鼠有疼痛反應(yīng)。

1.5 肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)

小鼠麻醉蘇醒后飼養(yǎng)1 d后，經(jīng)眼眶靜脈竇采血500μL，4 500 r∕min離心10 min后取血清，采用日立7080全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肝腎功能指標(biāo)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量結(jié)果以±s表示。組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，劑量與麻醉時(shí)間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻醉相關(guān)時(shí)間

舒泰和鹽酸賽拉嗪復(fù)合麻醉各組小鼠均麻醉成功（80∕80）。舒泰注射劑量為85 mg∕kg時(shí)，有40%的小鼠（8∕20）在麻醉恢復(fù)期出現(xiàn)氣管分泌物增多、呼吸痰鳴音的現(xiàn)象，共死亡3只小鼠（2雄1雌），死亡率15%。提示當(dāng)舒泰麻醉劑量在55～75 mg∕kg時(shí)能安全誘導(dǎo)小鼠麻醉，麻醉效果良好。

各劑量舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪進(jìn)行復(fù)合麻醉的誘導(dǎo)時(shí)間、維持時(shí)間、恢復(fù)時(shí)間和麻醉總時(shí)間數(shù)據(jù)見表1。隨著舒泰劑量增加，麻醉維持時(shí)間、麻醉恢復(fù)時(shí)間和總麻醉時(shí)間均延長(zhǎng)，而麻醉誘導(dǎo)時(shí)間縮短；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，各劑量組間的麻醉維持時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），麻醉維持時(shí)間與注射劑量成正比（雄鼠r2=0.827，雌鼠r2=0.841，P值均＜0.05），而麻醉誘導(dǎo)時(shí)間與注射劑量成反比（雄鼠r2=0.432，雌鼠r2=0.410，P值均P＜0.05）。

表1 不同劑量舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉時(shí)各組小鼠的麻醉時(shí)間比較Table 1 Comparison of the duration of anesthesia in each group under different anesthetic concentrations（t/min，±s，n=10）

注：與低劑量組（55 mg/kg組）比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與前一個(gè)劑量組之間比較，△△P＜0.01；雌（♀）雄（♂）鼠之間比較，▲▲P＜0.01。85 mg/kg劑量組麻醉后有3只小鼠死亡，2雄（a）1雌（b）。

項(xiàng)目麻醉誘導(dǎo)時(shí)間麻醉維持時(shí)間麻醉恢復(fù)時(shí)間總麻醉時(shí)間性別♂♀♂♀♂♀♂♀各劑量舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪55 mg/kg 14.32±6.16 14.26±2.85 12.03±3.19 11.11±3.56 19.26±8.64 23.02±4.77 40.25±14.58 46.89±6.93 65 mg/kg 11.55±3.30 12.6±2.29 31.76±3.78＊＊△△23.99±5.13＊＊▲▲△△22.14±5.86 28.62±5.68＊＊63.11±6.55＊＊63.59±7.99＊＊75 mg/kg 9.41±1.99＊11.07±2.82＊39.75±4.34＊＊△△39.67±8.28＊＊△△39.11±7.88＊＊35.15±11.12＊＊86.83±8.93＊＊84.46±11.31＊＊85 mg/kg 5.75±1.86＊＊8.33±2.86＊45.35±5.64＊＊46.67±5.68＊＊△△45.95±27.00＊＊a 46.27±20.24＊＊b 91.33±37.74＊＊a 103.84±16.41＊＊b

2.2 對(duì)肝腎功能的影響

用不同劑量的舒泰和鹽酸賽拉嗪復(fù)合麻醉，蘇醒后各劑量組小鼠的肝腎功能指標(biāo)與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05，表2）。

表2 不同劑量舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉蘇醒后各組小鼠的肝腎功能指標(biāo)比較Table2 Comparison of liver and kidney function indexes among different groups under different anesthetic concentrations（±s，n=10）

表2 不同劑量舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉蘇醒后各組小鼠的肝腎功能指標(biāo)比較Table2 Comparison of liver and kidney function indexes among different groups under different anesthetic concentrations（±s，n=10）

注：各劑量組與對(duì)照組之間比較，P＞0.05。85 mg/kg劑量組麻醉后有3只小鼠死亡，2雄1雌。

檢測(cè)項(xiàng)目谷丙轉(zhuǎn)氨酶z/(U·L-1)谷草轉(zhuǎn)氨酶z/(U·L-1)肌酐c/(μmol·L-1)性別♂♀♂♀♂♀對(duì)照組20.93±3.75 1 9.74±1.50 79.25±1 2.77 83.61±1 0.31 9.83±0.93 9.62±1.1 7各劑量舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪55 mg/kg 19.78±1.53 20.26±1.46 80.00±6.23 80.69±5.93 10.16±0.55 9.55±1.05 65 mg/kg 20.95±1.95 21.34±1.43 86.59±3.76 78.70±8.06 10.18±0.74 9.88±0.70 75 mg/kg 20.80±2.16 20.44±1.63 80.15±7.28 82.36±6.24 10.13±0.74 9.68±0.49 85 mg/kg 20.04±2.05 20.64±1.76 80.65±6.49 79.04±4.65 10.49±0.62 10.17±0.64

3 討論

在動(dòng)物手術(shù)實(shí)驗(yàn)中，麻醉是最基礎(chǔ)的一個(gè)操作，但麻醉的好壞會(huì)直接影響手術(shù)結(jié)果。目前較為常用的麻醉方式主要有吸入麻醉和注射麻醉。吸入麻醉效果較好，但使用時(shí)需要麻醉機(jī)配合，麻醉維持前需要使用誘導(dǎo)箱進(jìn)行誘導(dǎo)，操作較復(fù)雜，同時(shí)使用成本較高。相比吸入麻醉，注射麻醉操作簡(jiǎn)便，使用成本低。目前常用的麻醉劑有戊巴比妥鈉、三溴乙醇和異氟烷等。戊巴比妥屬于二類精神藥物，其購(gòu)買受到嚴(yán)格管控；三溴乙醇存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，可引起腹腔內(nèi)壁和腹部器官表面壞死及炎性改變［14］；異氟烷雖然麻醉效果好，但需要配合麻醉機(jī)使用，從而增加了實(shí)驗(yàn)成本。而舒泰可以很好地替代這些常用的麻醉劑。

舒泰是一種分離型麻醉劑，其主要成分為替來(lái)他明和唑拉西泮。其中，替來(lái)他明是一種麻醉劑，其藥理作用類似氯胺酮，主要抑制丘腦和新皮質(zhì)系統(tǒng)，可選擇性地阻斷痛覺沖動(dòng)傳導(dǎo)，使痛覺消失。舒泰具有誘導(dǎo)期迅速而平穩(wěn)、不良反應(yīng)小、止痛效果強(qiáng)等特點(diǎn)［16］。舒泰麻醉各類動(dòng)物的劑量分別為：靈長(zhǎng)類動(dòng)物4～6 mg∕kg，牛科動(dòng)物3.5～33 mg∕kg，靈貓科動(dòng)物2.6～6 mg∕kg［17］。相較于其他動(dòng)物，舒泰麻醉小鼠需要的劑量較高，一般為50～75 mg∕kg；并且在這個(gè)劑量范圍內(nèi)，小鼠麻醉深度不夠，四肢會(huì)無(wú)意識(shí)地劃動(dòng)；而使用劑量超過(guò)75 mg∕kg時(shí)，極易引起小鼠死亡［8］。這一點(diǎn)在本研究中得到了印證：當(dāng)舒泰麻醉劑量增加至85 mg∕kg時(shí)，小鼠會(huì)出現(xiàn)氣管分泌物增多，呼吸出現(xiàn)痰鳴音的現(xiàn)象，極易造成小鼠死亡；而舒泰麻醉劑量在55～75 mg∕kg時(shí)能迅速且安全地誘導(dǎo)小鼠麻醉，麻醉效果良好。另外，在麻醉過(guò)程中，舒泰對(duì)動(dòng)物體溫具有較強(qiáng)的降低作用［18］。故本實(shí)驗(yàn)在小鼠倒地后立即將其放置于保溫墊上，可有效保持其正常體溫，減輕動(dòng)物因體溫下降而導(dǎo)致的各類并發(fā)癥發(fā)生［15］。

在舒泰麻醉時(shí)聯(lián)合鹽酸賽拉嗪可有效提高麻醉質(zhì)量。鄒蘆等［8］曾使用替來(lái)他明／唑拉西泮（舒泰50）聯(lián)合右美托咪定對(duì)BALB∕c小鼠進(jìn)行麻醉時(shí)，得到了較好的麻醉效果；需要說(shuō)明的是，雖然其麻醉維持時(shí)間較更長(zhǎng)（達(dá)47～92 min），但其麻醉恢復(fù)時(shí)間也很長(zhǎng)（82～130 min），需注射阿替美唑來(lái)縮短動(dòng)物的麻醉恢復(fù)時(shí)間，操作較為復(fù)雜。相比而言，本研究的麻醉維持時(shí)間較短，在舒泰使用劑量為75 mg∕kg時(shí)，麻醉持續(xù)時(shí)間約為31～48 min，但這足以覆蓋大部分的動(dòng)物手術(shù)所需要的時(shí)間。同時(shí)，本研究中使用的麻醉方法恢復(fù)時(shí)間短，無(wú)需再次注射拮抗劑來(lái)縮短麻醉恢復(fù)時(shí)間，操作更為簡(jiǎn)便。而且本研究結(jié)果表明，在鹽酸賽拉嗪注射劑量不變的情況下，舒泰的麻醉維持時(shí)間與舒泰注射劑量成正比，故提示在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間的長(zhǎng)短選擇相應(yīng)的麻醉劑量，這樣可以有效減少麻醉劑的用量，縮短小鼠復(fù)蘇時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性來(lái)評(píng)價(jià)舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉對(duì)小鼠肝功能的影響。結(jié)果顯示麻醉蘇醒后1 d，實(shí)驗(yàn)組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，證明其肝臟功能良好。同時(shí)對(duì)小鼠血清中肌酐水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示麻醉蘇醒后1 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間小鼠血清中肌酐含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉對(duì)小鼠的腎功能也無(wú)明顯影響。可見舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉是一種比較安全的麻醉方法。

綜上所述，使用55～75 mg∕kg劑量的舒泰聯(lián)合鹽酸賽拉嗪麻醉7～8周齡的C57BL∕6J小鼠，可得到較好的麻醉效果且安全，并且通過(guò)調(diào)整麻醉劑量可控制麻醉時(shí)間，提示這是一種穩(wěn)定可靠的麻醉方法。

[作者貢獻(xiàn)]

王成稷：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)并分析，撰寫文章；

柴青：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采集并分析數(shù)據(jù)，文章內(nèi)容補(bǔ)充與整理；

龔慧、王玨、萬(wàn)穎寒和顧正頁(yè)：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)；

暴旭：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，技術(shù)支持；沈如凌：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，文章內(nèi)容補(bǔ)充與整理。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。