基于LXRs/NF-κB通路探討壯骨健膝方對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織炎癥的影響

陳 鵬，郭潔梅，肖 艷，王建輝，蘇友新*

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；

2 中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；

3 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）患者中約90%伴有滑膜組織炎癥表現(xiàn)，其嚴(yán)重程度與KOA 病程發(fā)展正相關(guān)［1］。KOA滑膜組織炎癥可通過加劇軟骨退化、加速膝關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成及軟骨下骨增生硬化進(jìn)一步加重KOA 的病理進(jìn)程［2-4］。核因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）通路激活可誘導(dǎo)相關(guān)下游炎癥因子的表達(dá)以加重炎癥反應(yīng)［5］，在KOA滑膜組織炎癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色［6］。研究表明，滑膜組織內(nèi)滑膜巨噬細(xì)胞中肝X 受體（liver X receptors，LXRs）可通過募集核受體輔助抑制因子（nuclear receptor co-repressor，N-CoR），間接抑制NF-κB 通路中P50、P65 參與的白介素-1β（Interleu?kin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子表達(dá)［7-8］，從而減輕KOA滑膜組織炎癥。壯骨健膝方是課題組根據(jù)KOA 病機(jī)特點(diǎn)總結(jié)的效驗(yàn)方，前期已開展該方延緩軟骨退化系列研究及減輕KOA 滑膜組織炎癥的動(dòng)物在體研究［9-10］。本研究擬進(jìn)一步從體外兔滑膜組織培養(yǎng)觀察角度，闡明壯骨健膝方對(duì)KOA 滑膜組織炎癥的干預(yù)效應(yīng)及機(jī)制，為其臨床推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

34 只健康新西蘭大白兔（簡(jiǎn)稱兔），雌雄各半，體質(zhì)量（2.0±0.3）kg，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供［許可證編號(hào)：SCXK（滬）2017-0008］，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)并飼養(yǎng)［許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

壯骨健膝方（骨碎補(bǔ)∶杜仲∶川牛膝∶生地黃∶獨(dú)活∶雞血藤∶秦艽∶徐長(zhǎng)卿∶?蟲=5∶3∶4∶5∶2∶5∶3.3∶3.3∶2），均購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定。按既定工藝濃縮至含生藥1 g/mL的藥液［10］。

1.3 試劑

木瓜蛋白酶（美國(guó)Sigma 公司，SLBR9817V）；烏拉坦（上海源葉生物科技有限公司，Z28N10Y10450 6）；兔IL-1β、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metal?loproteinase，MMP）-3、MMP-13 ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-030501、MM-024001、MM-018701、MM-148601）；LXRα 多克隆抗體、P65 多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，BJ01036276、AI07086414）；N-CoR 單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司，A1819）；P50 多克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司，ab194729）；LXRα 抑制劑5CPPSS-50（日本W(wǎng)ako 公司，WDM6507）；N-CoR 抑制劑ML-792（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司，66065）；DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone 公司，AE2916 3339）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（澳大利亞ExCellBio 公司，11G292）；D-Hank's 平衡鹽溶液（上海麥克林生物科技有限公司，C10878521）；增強(qiáng)型BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（080719191115）、SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（081519191016）均購(gòu)自上海碧云天生物科技研究所。

1.4 儀器

電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，YP202N）；切片機(jī)（德國(guó)LEICA 公司，RM2235）；攤片機(jī)（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，YF-7FB）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海掌動(dòng)網(wǎng)絡(luò)科技有限公司，PYX-DNS）；光學(xué)顯微鏡（德國(guó)LEICA 公司，DM4000B-LED）；超純水裝置（德國(guó)MILLIPORE 公司，MILLI-Q）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN 公司，64R）；CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Herarus，E163302）；倒置式系統(tǒng)顯微鏡（日本Olympus，BX41）；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BIO-TEK，ELX800）；垂直電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，Mini-PROTEAN Tetra）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，ChemiDoc XRS）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 兔含藥血清、空白血清的制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將12 只兔分為空白血清組和含藥血清組，每組6 只。根據(jù)前期研究并參照人與兔千克體質(zhì)量換算［11］，含藥血清組給予4.58 mL/（kg·d）壯骨健膝方藥液灌胃，每日分2次灌胃，空白血清組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃3 d。于末次灌胃1 h 后，行腹腔麻醉（20%烏拉坦5 mL/kg）后腹主動(dòng)脈采血。靜置2 h后，離心25 min（4 ℃，2 500 r/min），水浴滅活（56 ℃，30 min），微孔濾膜（0.22 μm）過濾，分裝于無(wú)菌50 mL 離心管并封口，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物模型的制備及鑒定

將22 只兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組和造模組，每組分別6 只和16 只。造模組采用兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法［12］造模，于造模的第1、4、7天對(duì)兔右后肢膝關(guān)節(jié)腔注入0.5 mL 2%木瓜蛋白酶水溶液。空白組同法注入0.5 mL 生理鹽水。于造模第14 天，觀察兔造模前后膝部皮溫、髕上周徑、Lequesne MG 量表評(píng)估情況［13］，并隨機(jī)選取空白組與造模組兔各3 只處死，無(wú)菌操作下切取右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織行HE 染色，以對(duì)模型進(jìn)行鑒定。以造模后兔膝部皮溫明顯升高、髕上周徑明顯增大及Lequesne MG＞4分為KOA模型鑒定成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 滑膜組織的采集及分組

模型鑒定成功后，將空白組剩余3 只兔及造模組剩余13 只兔無(wú)菌操作下切取右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜組織，浸入裝有無(wú)菌D-Hank's 液的無(wú)菌EP 管中保存。隨即轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)下，將無(wú)菌EP管中所有滑膜組織經(jīng)D-Hank's 液漂洗3 遍后，使用眼科手術(shù)剪仔細(xì)剔除滑膜周圍可見的脂肪組織，將滑膜組織剪碎成肉眼可見的大小約1～2 mm3小塊，收集60 小塊，隨機(jī)分為4 組，即模型組、壯骨健膝方組、LXRα 抑制劑組、N-CoR 抑制劑組，每組15 個(gè)組織塊，每孔3塊，每組5孔，置于6孔板中培養(yǎng)。同法取正常兔滑膜組織制備空白組，5孔。

2.4 滑膜組織體外培養(yǎng)、觀察與干預(yù)

將造模組滑膜小塊均勻排列置于無(wú)菌6 孔板中，視組織塊附著程度倒置1～2 h 后，沿孔壁緩緩加入適量含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，每日更換培養(yǎng)液1 次，置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察滑膜組織狀態(tài)，第3 天分別用10%空白血清、10%含藥血清、10%含藥血清＋5 μg/mL LXRα 抑制劑5CPPSS-50、10%含藥血清＋5 μg/mL N-CoR抑制劑ML-792進(jìn)行干預(yù)，每2 d換液1次，置于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)，空白組給予10%空白血清培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的干預(yù)時(shí)間為7 d，干預(yù)7 d后采集標(biāo)本。

2.5 樣本處理及指標(biāo)檢測(cè)

每組隨機(jī)選取6 個(gè)滑膜組織，4%多聚甲醛固定24 h 后脫水、包埋、切片以用于HE 染色觀察。剩余的組織塊采用移液槍移除培養(yǎng)液，濾紙吸干余下水分后，各組使用電子天平稱重取0.2 g 滑膜組織，放入玻璃勻漿管，加入1.8 mL PBS緩沖液，冰上研磨充分后收集勻漿液，離心10 min（4 ℃，3 000 r/min），取勻漿的上清液，冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆茫怨〦LISA 檢測(cè)；其余的滑膜組織置于研缽中，加入液氮研磨成粉狀后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，加入提前配制好的含有蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液∶蛋白酶抑制劑＝100∶1），冰上裂解5 min，然后離心20 min（4 ℃，12 000 r/min），收集上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫怨￤estern blot檢測(cè)。

2.5.1 兔滑膜組織HE 染色及評(píng)分 將包埋好的兔膝滑膜組織切片后進(jìn)行HE 染色，用LEICA 光學(xué)顯微鏡拍片觀察滑膜組織形態(tài)，每個(gè)滑膜切片選取5個(gè)視野（×200），進(jìn)行滑膜組織形態(tài)學(xué)評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)參照巫桁錁等［14］的方法，分別從4 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。見表1。

表1 滑膜病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Synovial pathology scoring criteria

2.5.2 兔膝滑膜組織中相關(guān)炎癥指標(biāo)的ELISA 檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)兔膝滑膜組織勻漿的上清液中IL-1β、TNF-α、MMP-3 和MMP-13 的含量。具體步驟按試劑盒說明書操作，于450 nm 處檢測(cè)吸光度，根據(jù)說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、MMP-3 及MMP-13含量。

2.5.3 兔膝滑膜組織中相關(guān)蛋白的Western blot 檢測(cè) 采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，Western blot 法檢測(cè)各蛋白表達(dá)。一抗稀釋比例為L(zhǎng)XRα（1∶300）、NCoR（1∶500）、P50（1∶500）、P65（1∶300）、β-actin（1∶8 000）；二抗稀釋比例為1∶10 000。將PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀上，滴加工作液，拍照，并記錄分析各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，不符合正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 兔KOA模型鑒定

造模前后造模組兔右后肢膝關(guān)節(jié)皮溫、關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG 評(píng)分比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)空白組滑膜呈半透明，滑膜層較薄且滑膜細(xì)胞呈單層整齊排列。造模組滑膜出現(xiàn)滑膜增生且滑膜細(xì)胞呈多層紊亂排列、炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)等改變。見表2和圖1。

圖1 光鏡下KOA兔膝滑膜組織病理HE染色圖（×200）Figure 1 Pathological observation of synovial tissue of KOA rabbits by HE staining under light micro?scope（×200）

表2 造模前后兔膝關(guān)節(jié)皮溫、關(guān)節(jié)周徑及Lequesne MG 得分等指標(biāo)比較（±s）Table 2 Rabbit knee joint skin temperature，circumference，Lequesne MG scores and other indicators before and after modeling（±s）

表2 造模前后兔膝關(guān)節(jié)皮溫、關(guān)節(jié)周徑及Lequesne MG 得分等指標(biāo)比較（±s）Table 2 Rabbit knee joint skin temperature，circumference，Lequesne MG scores and other indicators before and after modeling（±s）

注：與造模前比較，1）P＜0.05。Notes:Compared with that before modeling,1)P<0.05.

時(shí)間造模前造模后Lequesne MG評(píng)分/分0.00±0.00 6.67±1.441）n 16 16皮溫/℃33.90±0.13 37.00±0.211）關(guān)節(jié)周徑/cm 10.99±0.10 12.53±0.331）疼痛反應(yīng)/分0.00±0.00 1.67±0.491）步態(tài)/分0.00±0.00 2.08±0.671）關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍/分0.00±0.00 1.17±0.391）腫脹程度/分0.00±0.00 1.83±0.391）

3.2 5 組干預(yù)后滑膜組織HE 染色及形態(tài)學(xué)評(píng)分的變化情況

滑膜組織塊在整個(gè)培養(yǎng)及干預(yù)期間未出現(xiàn)明顯萎縮及色澤晦暗等表現(xiàn)。與空白組比較，模型組HE 染色可見滑膜內(nèi)襯層細(xì)胞增生且排列紊亂明顯、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生等改變，形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組可見滑膜內(nèi)襯層細(xì)胞輕度增生排列紊亂、稀疏散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及少量纖維組織增生等改變，形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.05）；分別與LXRα抑制劑組及N-CoR 抑制劑組比較，壯骨健膝方組病理改變形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 5組干預(yù)后滑膜組織形態(tài)學(xué)評(píng)分變化（±s）Table 3 Changes of synovial tissue morphology scores in five groups after intervention（±s）

表3 5組干預(yù)后滑膜組織形態(tài)學(xué)評(píng)分變化（±s）Table 3 Changes of synovial tissue morphology scores in five groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與壯骨健膝方組比較，3）P＜0.05。Notes:Compared with the blank group, 1) P<0.05; compared with the model group, 2) P<0.05; compared with the Zhuanggu Jianxi decoction group,3)P<0.05.

積分/分0.67±0.52 9.00±0.631）4.33±0.522）7.01±0.412）3）7.14±0.632）3）組別空白組模型組壯骨健膝方組LXRα抑制劑組N-CoR抑制劑組n66666

圖2 5組干預(yù)后滑膜組織HE染色圖（×200）Figure 2 HE staining of synovial tissue in five groups after intervention（×200）

3.3 5組干預(yù)后滑膜組織勻漿上清液IL-1β、TNFα、MMP-3和MMP-13含量變化

干預(yù)后與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組、LXRα 抑制劑組、N-CoR 抑制劑組上述指標(biāo)含量均顯著降低（P＜0.05）；分別與LXRα 抑制劑組和N-CoR 抑制劑組比較，壯骨健膝方組上述指標(biāo)含量均顯著降低（P＜0.05）。與干預(yù)前比較，干預(yù)后壯骨健膝方組IL-1β、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05）。見表4和表5。

表4 5組干預(yù)后滑膜IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（±s）Table 4 Comparison of IL-1β，TNF-α，MMP-3 and MMP-13 contents in synovial tissue of five groups after intervention（±s）

表4 5組干預(yù)后滑膜IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（±s）Table 4 Comparison of IL-1β，TNF-α，MMP-3 and MMP-13 contents in synovial tissue of five groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與壯骨健膝方組比較，3）P＜0.05。Notes:Compared with the blank group, 1) P<0.05; compared with the model group, 2) P<0.05; compared with the Zhuanggu Jianxi decoction group,3)P<0.05.

MMP-13/（μg/L）152.72±3.56 267.30±3.021）185.63±2.332）207.03±3.472）3）211.92±1.872）3）組別空白組模型組壯骨健膝方組LXRα 抑制劑組N-CoR 抑制劑組n33333 IL-1β/（ng/L）23.06±2.10 46.86±1.801）30.16±0.422）37.91±0.822）3）39.82±0.582）3）TNF-α/（pg/mL）112.58±7.67 348.98±5.541）187.46±10.442）248.07±8.532）3）242.53±7.562）3）MMP-3/（μg/L）20.03±0.63 31.58±1.181）20.09±1.762）26.51±0.742）3）26.95±0.032）3）

表5 壯骨健膝方組干預(yù)前后滑膜組織IL-1β和TNF-α含量比較（±s）Table 5 Comparison of IL-1β and TNF-α in synovial tis?sue in the Zhuanggu Jianxi decoction group be?fore and after intervention（±s）

表5 壯骨健膝方組干預(yù)前后滑膜組織IL-1β和TNF-α含量比較（±s）Table 5 Comparison of IL-1β and TNF-α in synovial tis?sue in the Zhuanggu Jianxi decoction group be?fore and after intervention（±s）

注：與干預(yù)前比較，1）P＜0.05。Notes:Compared with that before intervention,1)P＜0.05.

TNF-α/（pg/mL）349.55±3.07 187.46±10.441）時(shí)間干預(yù)前干預(yù)后n33 IL-1β/（ng/L）47.23±2.15 30.16±0.421）

3.4 5 組干預(yù)后滑膜組織LXRα、N-CoR、P50 和P65蛋白表達(dá)的變化

與空白組比較，模型組LXRα、N-CoR 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05），P50、P65蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05）。與模型組比較，壯骨健膝方組LXRα、N-CoR蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），P50、P65 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；LXRα 抑制劑組LXRα、N-CoR 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），P50、P65 蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.05）；N-CoR 抑制劑組LXRα蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），N-CoR 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），P50、P65 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。分別與LXRα抑制劑組及N-CoR抑制劑組比較，壯骨健膝方組LXRα、N-CoR 蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），P50、P65 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。見圖3和表6。

圖3 5組干預(yù)后滑膜組織蛋白電泳圖Figure 3 Protein electrophoresis of synovial tissue in five groups after intervention

表6 5組干預(yù)后滑膜組織中LXRα、N-CoR、P50及P65蛋白表達(dá)比較（±s）Table 6 Comparison of LXRα，N-CoR，P50 and P65 protein expression in synovial tissue in five groups after intervention（±s）

表6 5組干預(yù)后滑膜組織中LXRα、N-CoR、P50及P65蛋白表達(dá)比較（±s）Table 6 Comparison of LXRα，N-CoR，P50 and P65 protein expression in synovial tissue in five groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與壯骨健膝方組比較，3）P＜0.05。Notes:Compared with the blank group, 1) P<0.05; compared with the model group, 2) P<0.05; compared with the Zhuanggu Jianxi decoction group,3)P<0.05.

P65/β-actin 0.182 9±0.015 9 0.887 4±0.044 71）0.462 8±0.031 72）0.753 6±0.042 52）3）0.789 2±0.051 62）3）組別空白組模型組壯骨健膝方組LXRα抑制劑組N-CoR抑制劑組n33333 LXRα/β-actin 0.803 2±0.042 9 0.410 9±0.037 61）0.715 4±0.037 72）0.362 8±0.008 43）0.508 5±0.036 02）3）N-CoR/β-actin 0.864 1±0.053 3 0.399 7±0.020 51）0.706 9±0.028 02）0.378 6±0.048 43）0.345 4±0.015 83）P50/β-actin 0.167 5±0.012 5 0.835 5±0.080 41）0.469 6±0.021 82）0.691 0±0.034 22）3）0.717 6±0.067 82）3）

4 討 論

滑膜組織炎癥貫穿KOA 病程的各個(gè)時(shí)期［15］。KOA 滑膜組織炎癥不僅可加速膝關(guān)節(jié)的退變，還可導(dǎo)致疼痛、腫脹及僵硬等癥狀的發(fā)生及遷延。故抑制滑膜組織炎癥反應(yīng)以延緩膝關(guān)節(jié)病理改變、改善患者癥狀是目前KOA治療的重要環(huán)節(jié)之一［16］。

4.1 LXRs/NF-κB 通路對(duì)KOA 滑膜組織炎癥的調(diào)控作用

KOA 滑膜組織炎癥的病理表現(xiàn)包括滑膜內(nèi)襯層細(xì)胞增生及排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生等。一方面IL-1β、TNF-α等炎癥因子及MMPs可刺激滑膜組織導(dǎo)致其病理表現(xiàn)的加劇，另一方面滑膜組織炎癥反應(yīng)的加重可促使上述炎癥指標(biāo)含量的進(jìn)一步升高，最終形成惡性循環(huán)。研究顯示滑膜組織中滑膜細(xì)胞NF-κB 通路的活化在KOA 滑膜炎的發(fā)病過程中扮演著重要角色［17-18］。正常情況下，P65 和P50 與IκBα 以共聚體形式存在于胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)受到外界刺激后，IκBα 發(fā)生磷酸化并降解，P65 和P50 進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)IL-1β、TNF-α 等炎癥因子及MMPs 的表達(dá)［19］。研究表明，滑膜巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)LXRα 的活化可抑制巨噬細(xì)胞中的TLR3 或TLR4 從而參與調(diào)控炎癥介質(zhì)或MMPs 的分泌，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，具有較強(qiáng)的抗炎活性［20］。LXRα 激活后從胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在被SUMO 修飾的同時(shí)募集NCoR，啟動(dòng)“轉(zhuǎn)錄抑制”機(jī)制，從而間接抑制NF-κB通路的活化，最終緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)。由此可見，LXRs/NF-κB 通路上的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白可能是調(diào)控KOA滑膜組織炎癥的有效作用靶點(diǎn)。

4.2 壯骨健膝方可改善KOA滑膜組織炎癥

本研究認(rèn)為，“痹痿并見”是KOA 的主要特點(diǎn)之一，KOA 滑膜組織炎癥所致膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及僵硬等癥狀屬“痹”，行走或登梯無(wú)力、運(yùn)動(dòng)控制下降等癥狀屬“痿”，應(yīng)“痹痿并治”以除痹起痿［21］。壯骨健膝方經(jīng)多年臨床實(shí)踐總結(jié)而來，方中骨碎補(bǔ)、杜仲合用可補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；獨(dú)活、秦艽、?蟲、雞血藤四藥合用，可祛風(fēng)除濕，舒筋止痛，祛瘀生新；徐長(zhǎng)卿、川牛膝合用，則有強(qiáng)化補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕的效果；生地黃清熱滋陰，養(yǎng)血活血，全方共奏補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)之功效，痹痿同治。本課題組臨床研究證實(shí)，該方可改善KOA 患者膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及行走無(wú)力等“痹”“痿”癥狀［22］，據(jù)此圍繞“痹痿”，基于壯骨健膝方的療效及機(jī)制開展了系列基礎(chǔ)研究。體外研究發(fā)現(xiàn)，該方可能通過延緩軟骨細(xì)胞退變而發(fā)揮治痿的作用［9］；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，該方可顯著改善KOA 滑膜組織炎癥模型兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織生成等病理表現(xiàn)，降低組織形態(tài)學(xué)評(píng)分而治痹［10］，但治痹作用的具體機(jī)制尚不明確。

4.3 壯骨健膝方對(duì)兔KOA 滑膜組織炎癥LXRs/NF-κB通路的影響

本研究結(jié)果表明，模型組滑膜組織在炎性反應(yīng)的刺激性下出現(xiàn)了顯著的滑膜細(xì)胞增殖能力升高現(xiàn)象［23］，與文獻(xiàn)中慢性炎性反應(yīng)下成纖維細(xì)胞被激活、細(xì)胞表型改變、增殖能力升高并具備侵襲能力的報(bào)道類似［24］。滑膜組織HE 染色及形態(tài)學(xué)積分顯示，壯骨健膝方可有效減輕兔KOA 滑膜組織炎癥的病理表現(xiàn)，而當(dāng)LXRα、N-CoR 被抑制后則導(dǎo)致該病理表現(xiàn)加重。與空白組相比，模型組LXRα、N-CoR表達(dá)顯著下降，P50、P65 蛋白表達(dá)升高，IL-1β、TNF-α、MMP-3 及MMP-13 含量顯著升高，提示NF-κB 通路被激活。當(dāng)使用含藥血清干預(yù)后，與模型組相比，壯骨健膝方組LXRα、N-CoR 蛋白表達(dá)顯著升高，P50、P65蛋白表達(dá)顯著降低，提示NF-κB通路受到抑制。當(dāng)含藥血清中分別加入LXRα 及NCoR 抑制劑后，LXRα 及N-CoR 抑制劑組P50、P65蛋白表達(dá)顯著上升，導(dǎo)致下游相關(guān)炎癥指標(biāo)含量顯著升高，提示NF-κB 通路被激活，也證實(shí)壯骨健膝方對(duì)NF-κB 通路的抑制作用，可能是通過上調(diào)LXRα表達(dá)、募集N-CoR而實(shí)現(xiàn)的。

綜上，本研究結(jié)果從兔滑膜組織水平證實(shí)，壯骨健膝方可有效改善兔KOA 滑膜組織炎癥的病理表現(xiàn)，其機(jī)制可能與其上調(diào)滑膜組織中滑膜細(xì)胞LXRs/NF-κB 通路LXRα、N-CoR 蛋白表達(dá)，從而下調(diào)P50、P65 蛋白，進(jìn)而減少下游IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13的含量有關(guān)。然而，動(dòng)物滑膜組織與人滑膜組織存在一定的組織差異性，故含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的兔滑膜組織僅能部分解釋壯骨健膝方對(duì)人KOA 滑膜組織炎癥的作用機(jī)制。因此，有必要進(jìn)一步開展人滑膜組織及滑膜細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究以印證本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，從而多層次、多角度豐富該方治痹的內(nèi)涵。