早期母愛剝奪影響邊緣系統(tǒng)-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路致大鼠成年后抑郁的機制研究

潘楠楠 盧浩揚 周列民 寧玉萍 方子妍▲

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院神經(jīng)科腦電圖室，廣東廣州 510370；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510370；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東廣州 510080；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院研究所，廣東廣州 510370

抑郁癥是常見的精神心理疾病，據(jù)WHO 報道全球約有3.5 億抑郁癥患者[1]。抑郁癥機制的研究是目前精神心理疾病研究的重點問題。出生后3～4年內(nèi)（對大鼠相當(dāng)于出生后1～14 d） 是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，研究證實在這個時期經(jīng)歷持續(xù)應(yīng)激，對其成年以后的行為及心理發(fā)育造成不利的影響[2]，精神心理疾病的易感性顯著增加[3]。研究發(fā)現(xiàn)早年應(yīng)激（early life stress, ELS）可以增加成年后抑郁癥的患病風(fēng)險[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠出生后早期母愛剝奪可致成年后的抑郁樣行為，而這種行為的產(chǎn)生與母愛剝奪引起海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少有關(guān)[5]。目前關(guān)于ELS致成年后抑郁癥易感性增加的機制尚不完全清楚，有研究者提出可能與ELS 造成大腦情感調(diào)節(jié)環(huán)路相關(guān)區(qū)域神經(jīng)系統(tǒng)可塑性改變有關(guān)[6]。

邊緣系統(tǒng)-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路（limbic-thalamic-cortical, LTC）對情感調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)具有重要作用，與情緒加工、記憶和控制網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)[7]。研究證據(jù)證實抑郁癥患者腦部的器質(zhì)性病變主要定位于LTC 中[8]。本研究選用出生后早期母愛剝奪致抑郁大鼠模型為研究對象，采用盲法觀察早期母愛剝奪對成年大鼠前額葉、海馬區(qū)及丘腦神經(jīng)元數(shù)目及星形膠質(zhì)細(xì)胞表達的影響，驗證ELS 致大鼠成年后抑郁樣障礙中LTC 參與致病的現(xiàn)象，可望為臨床尋找抑郁致病機制提出病理生理方面的基礎(chǔ)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 SPF 級SD 孕鼠購于廣東省動物中心[許可證號：SCXK（粵）2008-0002]。大鼠按照隨機數(shù)字表法分為母愛剝奪組（n=20）和對照組（n=20）。本實驗開始前獲得廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。在整個實驗過程中采用盲法進行實驗操作：課題設(shè)計者對實驗動物及標(biāo)本進行編號，并在整個實驗過程中保密，實驗操作者進行操作時隨機選取動物及標(biāo)本。

1.1.2 儀器與試劑 恒冷箱冷凍切片機（Leica 公司，CM1800型）；光學(xué)顯微鏡（Olypus 公司，BX62）；兔抗大鼠Neun多克隆抗體（abcam 公司，ab177487）、小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體(abcam 公司，ab4648)、山羊抗小鼠IgG H&L(abcam 公司，ab150115)、 驢抗兔IgG H&L (abcam 公司，ab150073)。

1.2 實驗方法

1.2.1 母愛剝奪應(yīng)激 母愛剝奪組大鼠從出生后第1天上午9:00～12:00 開始接受母愛剝奪：將母鼠從幼鼠籠移出，幼鼠籠放進30～34℃的恒溫箱內(nèi)，分離結(jié)束后再將母鼠放回原來的幼鼠籠內(nèi)，每日1 次，持續(xù)14 d。對照組大鼠不予以任何處理。

1.2.2 動物行為評估 兩組大鼠在飼養(yǎng)至2 個月齡時進行動物行為評估。評估內(nèi)容具體如下。①糖水偏愛實驗。大鼠單籠飼養(yǎng)，給予相同的兩瓶清水，2 d 后，將清水替換為1%蔗糖水，2 d 后大鼠禁水16 h，后給予事先稱好重量的清水和1%蔗糖水各一瓶，分別放在之前相同位置，2 h 后將兩水瓶調(diào)換位置，4 h 后，取下瓶子稱重。計算各大鼠的蔗糖水飲用量及蔗糖偏愛率（蔗糖水飲用量/總飲水量×100%）。②社交實驗：將大鼠單獨放入有一只同性陌生大鼠的新籠內(nèi)并開始計時，記錄大鼠放入到與陌生大鼠第一次主動互動的潛伏期(鼻子對鼻子互嗅或者鼻子嗅對方肛門，隨后爬到大鼠背上），用來表示大鼠社交活動主動性。

1.2.3 取材 大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4℃的生理鹽水經(jīng)心臟沖洗后灌注4%多聚甲醛，取大腦經(jīng)4%多聚甲醛后固定4～6 h，后依次經(jīng)20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，冰凍切片機冠狀位連續(xù)切片，片厚10 μm，每隔5 張取1 張腦片。置于-40℃冰箱備用。

1.2.4 Neun 免疫熒光染色 隨機取出冰凍切片，室溫下復(fù)溫，加0.3%TritonX-100，室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS 洗3 次；加封閉液，室溫孵育1 h；加單克隆小鼠抗大鼠Neun 抗體在4℃孵育16 h；0.01 mol/L PBS 洗3次，加二抗，室溫避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS 洗3次；加封片劑封片；共聚焦顯微鏡400 倍鏡下觀察、拍照。使用ImageJ 軟件進行細(xì)胞計數(shù)分析。

1.2.5 GFAP 免疫熒光染色 隨機取出冰凍切片，室溫下復(fù)溫10 min，加0.3%TritonX-100，室溫孵育l0 min，0.01 mol/L PBS 洗3 次；加封閉液，室溫孵育1 h；加單克隆小鼠抗大鼠GFAP 抗體在4℃孵育16 h；0.01 mol/L PBS 洗3 次，加二抗，室溫避光孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗3次；加封片劑封片；共聚焦顯微鏡400 倍鏡下觀察、拍照。使用Image J 軟件進行細(xì)胞計數(shù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠成年后行為學(xué)評估結(jié)果

母愛剝奪組大鼠蔗糖偏愛率少于對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；母愛剝奪組大鼠第一次主動與陌生大鼠互動潛伏期長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表1 兩組大鼠成年后行為學(xué)評估結(jié)果（±s）

表1 兩組大鼠成年后行為學(xué)評估結(jié)果（±s）

母愛剝奪組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值58.54±5.02 79.01±4.04 3.18 0.008 84.57±5.71 53.00±5.52 3.97 0.002組別 蔗糖偏愛率（%） 主動與陌生大鼠互動潛伏期（s）

2.2 大鼠前額葉、 海馬及丘腦Neun 免疫熒光染色計數(shù)神經(jīng)元

兩組大鼠前額葉、 海馬及丘腦Neun 免疫熒光染色結(jié)果于400 倍鏡下拍照，使用Image J 軟件對相同部位進行細(xì)胞計數(shù)分析。計數(shù)結(jié)果示母愛剝奪組大鼠前額葉、 海馬及丘腦Neun 陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖1（封三）。

圖1 Neun 染色結(jié)果

表2 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦Neun 染色陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果（個，±s）

表2 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦Neun 染色陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果（個，±s）

母愛剝奪組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值22.35±2.71 31.24±5.49 6.25＜0.001 119.90±10.84 139.55±6.79 7.13＜0.001 32.14±5.31 40.60±6.88 5.01＜0.001images/BZ_15_212_2179_1205_2234.png

2.3 大鼠前額葉、 海馬及丘腦區(qū)GFAP 免疫熒光染色結(jié)果

兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 免疫熒光染色結(jié)果于400 倍鏡下拍照，計數(shù)GFAP 染色陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，母愛剝奪組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 染色陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3、圖2（封三）。

表3 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 染色陽性結(jié)果（個，±s）

表3 兩組大鼠前額葉、海馬及丘腦GFAP 染色陽性結(jié)果（個，±s）

母愛剝奪組（n=20）對照組（n=20）t 值P 值8.60±2.33 11.40±2.48 4.99＜0.001 13.10±2.17 19.70±2.20 10.08＜0.001 10.55±1.36 16.76±2.76 8.40＜0.001images/BZ_15_1275_334_2268_389.png

圖2 GFAP 熒光染色結(jié)果

3 討論

抑郁癥患病率、致殘率高，給患者及其家屬、社會帶來嚴(yán)重的危害和經(jīng)濟損失[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)出生早期發(fā)育階段的持續(xù)性應(yīng)激事件可以損害大腦的結(jié)構(gòu)和功能[5，10]，使其在成年后個體患抑郁癥風(fēng)險明顯升高[11]。目前關(guān)于出生后早期應(yīng)激事件增加成年后患抑郁癥風(fēng)險的發(fā)病機制尚不清楚，深入探討早期母愛剝奪致成年后患抑郁癥風(fēng)險增加的病理機制，對于預(yù)防抑郁癥具有重要的意義。

早年應(yīng)激可引起的不同腦區(qū)的功能障礙，最早引起人們注意是前額葉在早期應(yīng)激中的作用，后來人們逐漸發(fā)現(xiàn)前額葉與多個腦功能區(qū)通過雙相聯(lián)系在應(yīng)激的易化負(fù)反饋抑制通路中發(fā)揮作用，這些腦區(qū)包括邊緣系統(tǒng)及丘腦等[12]。研究發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)激與前額葉、海馬等多個腦區(qū)體積減小相關(guān)[13]，經(jīng)歷早期應(yīng)激的抑郁癥患者其海馬體積較沒有經(jīng)歷早期應(yīng)激的抑郁癥患者顯著減小[14]。有研究者提出早年應(yīng)激或許是抑郁癥的獨立性危險因素，且與抑郁癥患者大腦多個腦區(qū)的器質(zhì)性異常有關(guān)[15]。

近年來研究證實抑郁癥也與不同腦區(qū)、多個網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能改變有關(guān)聯(lián)[16]，這些器質(zhì)性病變主要集中在LTC 上。前額葉、海馬、丘腦是LTC 的重要節(jié)點，在情緒調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)中具有重要的作用[17]。前額葉與情緒、記憶及執(zhí)行能力等密切相關(guān)，前額葉功能異常會影響情緒、認(rèn)知及行為的調(diào)節(jié)，前額葉的這種調(diào)節(jié)異常被認(rèn)為是抑郁癥診斷中情緒、認(rèn)知及行為癥狀的核心機制[18]。海馬區(qū)是參與情緒記憶的重要腦區(qū)，也是前額葉皮質(zhì)功能的重要調(diào)節(jié)器，海馬功能的異常可能與抑郁癥中常見的應(yīng)激調(diào)節(jié)異常、 注意力不集中及記憶障礙相關(guān)。丘腦是大腦功能信息進行整合的重要腦區(qū)，通過不同的通路與不同腦區(qū)進行聯(lián)系，在情緒處理、認(rèn)知及記憶中具有重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)前額葉、海馬、丘腦在抑郁癥患者存在明顯的活動異常[19-20]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中具有極其重要的作用，其與抑郁癥的關(guān)系也逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)。有研究者提出“三重突觸”概念，認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞是構(gòu)成突觸的第三成分，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮[21]。星形膠質(zhì)細(xì)胞與超過90%谷氨酸重吸收和代謝有關(guān)[22]。星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙會造成神經(jīng)元的損傷，造成神經(jīng)元的丟失[22]。

本研究通過早期母愛剝奪建立大鼠抑郁模型，在經(jīng)過14 d 早期母愛剝奪應(yīng)激后，大鼠成年后的其行為學(xué)明顯出現(xiàn)快感缺失、社交回避等表現(xiàn)，很好的模擬了人類的抑郁癥狀，成功建立了早期母愛剝奪致成年大鼠抑郁模型。為進一步了解早期母愛剝奪致大鼠成年后抑郁的病理機制，本研究通過Neun 免疫熒光染色來標(biāo)記神經(jīng)元，采用GFAP 免疫熒光染色來計數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目，觀察早期母愛剝奪對成年大鼠前額葉、 海馬及丘腦神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期母愛剝奪組大鼠前額葉、海馬區(qū)神經(jīng)元及GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組，這與之前他人的研究一致[23-24]。在實驗中還觀察了出生后早期母愛剝奪對丘腦神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的影響，發(fā)現(xiàn)母愛剝奪組大鼠丘腦神經(jīng)元及GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)目較對照組也顯著減少。因此本研究推測早年母愛剝奪應(yīng)激對大鼠前額葉、海馬及丘腦區(qū)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞均造成嚴(yán)重的損傷，使其數(shù)目顯著減少，從而影響其正常功能，致使LTC 結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常，從而構(gòu)成大鼠成年后出現(xiàn)抑郁樣行為學(xué)改變的病理基礎(chǔ)。

綜上所述，早期母愛剝奪可致LTC 重要組成部分前額葉、 海馬及丘腦區(qū)的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著減少，推測LTC 可能是參與早年應(yīng)激致成年后抑郁的重要病理機制。但本研究僅觀察了前額葉、 海馬、 丘腦區(qū)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的改變，其具體的分子及信號機制尚不清楚，后續(xù)還需進一步研究。