伽師瓜無(wú)菌播種及愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)初探

卡力比努爾·艾沙，圖爾蓀妮薩·艾合麥提，熱依拉·艾買爾，李 爽，趙 亮

喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844006

伽師瓜的種植歷史十分久遠(yuǎn)，在南北朝時(shí)，伽師瓜因其獨(dú)特的口感而獲得較高的評(píng)價(jià)。在清朝時(shí)期，伽師瓜被獻(xiàn)給當(dāng)時(shí)的朝廷重臣和皇族。“伽師”甜瓜因其肉質(zhì)厚細(xì)、香甜清脆、濃汁、皮薄無(wú)網(wǎng)紋、耐儲(chǔ)存等特點(diǎn)，具有“中國(guó)瓜王”的稱號(hào)。伽師瓜原產(chǎn)于新疆喀什地區(qū)的伽師縣，伽師縣地處新疆西南地區(qū)，具有西高東低，北高南低的獨(dú)特地勢(shì)，具有適宜的獨(dú)特氣候和水土條件。伽師瓜是喀什地區(qū)特色經(jīng)濟(jì)作物，也是伽師縣農(nóng)牧民收入的主要來(lái)源。伽師瓜外觀優(yōu)美，含糖量高，香甜可口，肉厚汁豐，品質(zhì)優(yōu)良，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，在食品加工、醫(yī)學(xué)等方面也有很多用途。據(jù)調(diào)查，目前伽師瓜在生產(chǎn)中主要存在品種退化，病蟲害；單果大小差異大等問(wèn)題，通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得優(yōu)良康尼基因，進(jìn)而明確這些基因的功能是十分必要的。

將植物組織培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)以及誘變育種等技術(shù)結(jié)合起來(lái)應(yīng)用，可大大縮短作物遺傳改良所需的年限，獲得優(yōu)良抗逆性狀。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，獲得優(yōu)良抗逆基因在林果栽培種已有應(yīng)用，如減少植株和瓜果的病蟲害，有望實(shí)現(xiàn)在其他地區(qū)栽培，這也許能給南疆更多的農(nóng)牧民生產(chǎn)增收帶來(lái)巨大效益。但前提是通過(guò)植株離體再生培養(yǎng)，獲得遺傳背景一致的再生苗，從而獲得穩(wěn)定的優(yōu)良基因。目前，就伽師瓜離體再生技術(shù)而言，關(guān)于其無(wú)菌播種和愈傷組織的誘導(dǎo)的最佳條件并沒(méi)有給出統(tǒng)一的答案。因此，本研究選擇伽師瓜為試驗(yàn)材料，以離體子葉和莖段開(kāi)展愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)的研究，旨在掌握植物組織培養(yǎng)的基本技能，為建立伽師瓜幼苗離體再生體系提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

伽師瓜種子購(gòu)自于喀什農(nóng)博城種子專營(yíng)店，常規(guī)種。

1.2 無(wú)菌播種

參考朱新霞等人的方法配制MS培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)至pH（5.9±0.1），于高壓滅菌鍋中121℃條件下滅菌20min。種子分別為去殼和不去殼處理，分別經(jīng)75%酒精消毒60s，10%次氯酸鈉或0.1%氯化汞消毒15min，在超凈工作臺(tái)上待種子晾干，播于MS培養(yǎng)基上，每瓶播種5粒。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法

取5d的伽師瓜無(wú)菌苗，在無(wú)菌條件下，將子葉除去邊緣切成0.5cm×0.5cm的小塊，接種于含不同濃度的6-BA的培養(yǎng)基中（0.2mg/L6-BA＋MS、0.4mg/L6-BA＋MS、1.0mg/L6-BA＋MS、2mg/L6-BA＋MS），每瓶中接種8塊；將莖部切為每段0.5cm的莖段，接種于含不同濃度的6-BA的培養(yǎng)基中（0.2mg/L6-BA＋MS、0.4mg/L 6-BA＋MS、1.0mg/L6-BA＋MS、2mg/L6-BA＋MS），每瓶接種8塊。將接種好的培養(yǎng)瓶放置在2200lx光照下培養(yǎng)，每2d觀察一次愈傷組織生長(zhǎng)情況，約30～40d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的數(shù)量，并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

2 結(jié)果分析

2.1 不同處理方法對(duì)無(wú)菌苗生長(zhǎng)的影響

如表1所述，去殼的種子與未去殼的種子相比，去殼的種子在MS培養(yǎng)基中更容易發(fā)芽，分別用次氯酸鈉和氯化汞消毒后伽師瓜種子萌發(fā)率達(dá)到85%和90%，生長(zhǎng)的無(wú)菌苗污染率低。未去殼的種子，盡管用次氯酸鈉和氯化汞消毒后，種子也僅有一半萌發(fā)。

表1 未去殼的種子與去殼的種子形成無(wú)菌苗的概率

2.2 不同部位的外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

6-BA誘導(dǎo)莖段形成的愈傷組織見(jiàn)表2，可以看出濃度為0.4mg/L6-ba+ms的培養(yǎng)基中，莖段的誘導(dǎo)率為達(dá)到93%。在沒(méi)有加入6-ba的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率為0。接種在1.0mg/L6-ba+ms和2.0mg/L6-ba+ms的培養(yǎng)基上的莖端，盡管也能誘導(dǎo)形成愈傷組織，愈傷組織褐變率較高。

表2 含不同濃度6-BA對(duì)誘導(dǎo)莖段形成愈傷組織的影響

不同濃度6-BA誘導(dǎo)子葉形成的愈傷組織見(jiàn)表3，其中濃度為0.4mg/l6-ba+ms的培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率為最高達(dá)到90.6%。在沒(méi)有加入6-ba的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率為0。接種在1.0mg/l6-ba+ms和2.0mg/l6-ba+ms的培養(yǎng)基上的子葉，愈傷組織褐變率較高。

表3 不同濃度6-BA對(duì)誘導(dǎo)子葉形成愈傷組織的影響

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，無(wú)菌操作對(duì)種子的消毒滅菌處理很重要，將伽師瓜常規(guī)種去殼與未去殼對(duì)比，去殼種子的發(fā)芽率更高，這與王愛(ài)玲等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[8]。未去殼種子由于外種皮的存在萌發(fā)時(shí)要突破培根，萌發(fā)時(shí)間更長(zhǎng)，且外殼帶有細(xì)菌，生長(zhǎng)的無(wú)菌苗易受到污染，而去殼種子可直接萌發(fā)，發(fā)芽率更高。多次實(shí)驗(yàn)證明一旦無(wú)菌苗染菌，那么以其作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)期間也會(huì)染菌。所以在對(duì)除去外殼的種子滅菌時(shí)要嚴(yán)格對(duì)外植體消毒充分。

在探究誘導(dǎo)愈傷組織最佳部位、最適6-BA濃度時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制培養(yǎng)基的6-BA濃度，得出以莖部與子葉為外植體在0.4mg/L的6-BA+MS培養(yǎng)基中形成的愈傷組織最好，這結(jié)果與付秋實(shí)等人的研究結(jié)果稍有差異。6-BA濃度過(guò)低不容易生成愈傷組織，孫敬三等研究表明，隨著6-BA濃度升高，組織塊的玻璃化也愈嚴(yán)重。這可能與內(nèi)外源激素達(dá)到特定得平衡狀態(tài)和激素受體存在飽和狀態(tài)有關(guān)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可明顯看出，在濃度為0.4mg/L6-ba+ms的培養(yǎng)基中,以莖部作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體時(shí)，其誘導(dǎo)率都比子葉作為外植體時(shí)的誘導(dǎo)率高出2.4%。表明在相同培養(yǎng)條件下，即使是同一植株的不同外植體，其愈傷組織的誘導(dǎo)能力也不同，這可能與構(gòu)成不同外植體的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律及調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)的內(nèi)源激素有關(guān)，這與孫慶軍等人的研究結(jié)果相似。其結(jié)果表明，在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，除甜瓜子葉和下胚軸能產(chǎn)生不定芽外，其余外植體均未能誘導(dǎo)出不定芽。本實(shí)驗(yàn)表明，伽師瓜只有在莖段形成的愈傷組織可以分化出不定芽來(lái)，這刻與孫慶軍等人的研究材料、外植體生理狀態(tài)及培養(yǎng)基配比不同有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)得出，伽師瓜無(wú)菌播種的最佳方式為：種子除去外殼，在75%的酒精中處于黑暗條件下培養(yǎng)成無(wú)菌幼苗；伽師瓜的愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件為：以5d的無(wú)菌苗莖部為外植體，在0.4mg/L6BA+MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)形成的愈傷組織最好。