恒溫隔絕式熒光PCR 檢測非洲豬瘟病毒核酸方法的建立

陳雪蓉，徐 林，王遠微，湯 承，岳 華

（1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川成都 610041；2.甘孜州動物疫病預防控制中心，四川康定 626000）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，對生豬致病率及致死率高[1]。該病2018 年傳入我國，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失[2-3]。ASF 的臨床癥狀及病理變化與古典豬瘟（classical swine fever，CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）相似，只能通過實驗室才能確診。目前尚無有效預防ASF 的疫苗，及時準確的診斷對ASF 防控至關重要[4]。PCR 現(xiàn)已廣泛用于多種動物病原的檢測[5]。我國農村農業(yè)部推薦使用傳統(tǒng)熒光定量PCR 檢測方法進行ASF 診斷，但該方法需要復雜的儀器，耗時較長。恒溫隔絕式熒光PCR（insulated isothermal PCR，iiPCR）是一種基于Rayleigh-Benard 對流原理設計的新型熒光PCR 技術，在配好檢測體系后僅需將毛細管放入儀器內，一鍵啟動，無需設置擴增程序和分析擴增曲線，可自動在顯示屏上顯示檢測結果。該方法對于DNA 和RNA 檢測都具有極好的靈敏度和特異性[6]。與實時熒光定量PCR、瓊脂糖凝膠電泳鑒定的傳統(tǒng)PCR 或熱循環(huán)式PCR 技術不同，該技術實現(xiàn)了核酸分析儀的小型化，讓PCR 檢測走出實驗室，實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。目前，iiPCR 檢測技術已被廣泛用于多種動物疫病的快速檢測[7-13]。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸和臨床樣本

豬細小病毒（PPV）WH-1株、豬瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）GDr 株、豬偽狂犬病病毒（PRV）Bartha-k61 株、豬乙腦病毒（JEV）SA14-14-2 株，均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬流行性腹瀉病毒（PEDV）分離株swun620、ASFV 核酸，由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室提供，用于特異性評價。

51 份ASFV 陽性樣本核酸及49 份ASFV 陰性樣本，均由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室（四川省ASF 定點檢測實驗室）提供，用于檢測方法的比較。

1.2 主要試劑

pMD19-T 克隆載體、DH5α 感受態(tài)細胞、DL 500 DNA Marker、TPremix ExTaq（Probe qPCR Mix），購于寶生物工程（大連）有限公司；Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒，購于OMEGA BIOTEK 公司；PetNAD 核酸萃取試劑盒，由金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司生產提供。

1.3 主要儀器

移液器，購自德國Eppendorf 公司；核酸蛋白分析儀，購自日本島津公司；電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)，購自上海天能科技有限公司；熒光定量PCR儀（Quant Studio 3），購自杭州博日公司；小型離心機（cubee?）、POCKIT Micro Plus 核酸八通道分析儀，購自廈門金瑞鴻捷公司。

1.4 引物合成

采用農業(yè)農村部172 號公告推薦的ASFV 熒光定量PCR 檢測方法的引物（F：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'；R：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'）和探針（5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'）。擴增P72基因目的片段，長度為63 bp。引物和探針，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 核酸提取

用于特異性檢驗的毒株，均采用酚-氯仿-異戊醇法和Trizol 法提取DNA 和RNA。DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆茫琑NA反轉錄成cDNA保存于-20 ℃。

1.6 ASFV 標準樣品準備

采用1.4 中的引物對，以ASFV 陽性的DNA為模板進行常規(guī)PCR 擴增，PCR 產物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶用Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收并連接到pMD19-T 載體上，隨后轉化DH5α 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并提取質粒，將測序正確的陽性質粒作為本研究的陽性標準品，用核酸蛋白分析儀測定其質量濃度（μg/mL），按照下述公式換算成copies/μL。

陽性標準品濃度（copies/μL）=陽性標準品質量濃度×10-9×6.02×1023/（660×質粒總長度）。

1.7 反應體系優(yōu)化

采用50.00 μL 反應體系，對體系中的上下游引 物濃 度10 μmol/μL（0.50～5.00 μL）、探針 濃度10 μmol/μL（0.05～0.50 μL）、Taq預混酶5 U/μL（22.00～28.00 μL）進行優(yōu)化。以PCR 檢測前讀取的熒光值（A520）與檢測后讀取的熒光值（B520）的比值R1 最大，為最佳體系的判定標準。

1.8 特異性評價

用本研究建立的檢測ASFV 核酸的 iiPCR 方法，對PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸進行檢測，以ASFV 核酸作為陽性對照，去離子水作為陰性對照，對陽性核酸擴增產物送上海生工生物工程有限公司測序，以評價ASFV iiPCR方法的特異性。

1.9 靈敏度測定

用本研究建立的檢測ASFV 核酸的 iiPCR 方法，對陽性標準品梯度稀釋（10-1～10-14）后進行檢測，以去離子水作為陰性對照，測定本研究建立的iiPCR 方法的檢測下限。

1.10 穩(wěn)定性評價

用本研究建立的 iiPCR 方法，對6 個稀釋度的ASFV 重組質粒標準品（10-6～10-11）進行檢測，每個稀釋度設3 個復孔，評價其批內重復性；同時以這些陽性標準品為模板，每間隔1 d，進行3 次獨立檢測，檢測其批間重復性。

1.11 與傳統(tǒng)熒光定量PCR 方法比較

采用本研究建立的iiPCR 方法和農業(yè)農村部172 號公告推薦的熒光定量PCR 方法，同時對51份ASFV 陽性樣本核酸及49 份ASFV 陰性樣本進行檢測，比較兩種方法的檢出情況。

2 結果

2.1 反應體系優(yōu)化

本研究建立的檢測ASFV 的 iiPCR 方法的優(yōu)化反應體系見表1。

表1 優(yōu)化的ASFV iiPCR 反應體系

2.2 特異性

用本研究建立的檢測ASFV 的iiPCR 方法，從ASFV 陽性樣本中擴增目的片段，測序結果證明目的片段為63 bp，是ASFVP72基因的特異片段，而 對PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸樣本擴增結果均為陰性，表明建立的ASFV iiPCR 檢測方法特異性良好（圖1）。

2.3 檢測限

用核酸蛋白分析儀測定ASFV 陽性標準品的質量濃度為176 μg/mL，代入1.6 的公式換算核酸濃度為2.55×1012copies/μL。對標準品進行倍比稀釋（2.55×1011～2.55×100copies/μL）后，iiPCR 方法靈敏度檢測結果顯示，該方法對ASFV 核酸最低檢測限為2.55 copies/μL（圖2-A），與農業(yè)農村部推薦的熒光定量PCR 方法靈敏度檢測下限一致（圖2-B），說明本研究建立的方法具有較好的靈敏度。

2.4 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性試驗結果見表2。該方法的批內變異系數(shù)為0.61%～1.79%，批間變異系數(shù)為0.82%～1.86%。對6 個濃度陽性標準品檢測的變異系數(shù)均小于2%，表明建立的ASFV iiPCR 方法穩(wěn)定性好。

表2 iiPCR 穩(wěn)定性測試結果

2.5 與傳統(tǒng)熒光定量PCR 的符合率

用本研究建立的iiPCR 與傳統(tǒng)熒光PCR 檢測的符合率見表3。計算公式：符合率=TN/（TN+FP）×100%（TN 為真陰性，F(xiàn)P 為假陽性）。從表3 可見，本研究建立的iiPCR 方法和農業(yè)農村部推薦的熒光定量PCR 方法，對ASFV 陽性樣本和陰性樣本中核酸檢出結果一一對應，完全一致，表明本研究建立的檢測ASFV 的iiPCR 方法準確可靠。

表3 兩種檢測方法對ASFV 的檢測結果

3 討論

3.1 實現(xiàn)了ASFV 的現(xiàn)場診斷

傳統(tǒng)的熒光定量PCR 測定需要大型、復雜、昂貴的儀器，這些儀器只能存放在實驗室中，且檢測時間較長。現(xiàn)場診斷技術可以解決這些問題，并可避免運輸傳染性材料導致的一些潛在危險[14]。目前已經(jīng)開發(fā)了一些便攜式分子檢測方法，用于快速現(xiàn)場檢測ASFV[15-20]。但國內還未見有ASFV iiPCR 現(xiàn)場檢測方法的報道。基于iiPCR 原理研發(fā)的POCKIT? 智能型核酸分析儀，小巧便攜，自帶電源，PCR 檢測一鍵操作，檢測過程僅需42 min，且因檢測過程在閉管內一次完成，避免氣溶膠的產生，已被廣泛運用于牛輪狀病毒[9]、牛傳染性鼻氣管炎病毒[11]、豬輪狀病毒[10]、PEDV[21]、蝦白斑病病毒[22-23]、馬流感病毒[24]、犬瘟熱病毒[25]等動物疫病病原的快速檢測，其中采用該技術建立的對蝦白斑病病毒檢測方法已得到OIE 認證[22-23]。本研究建立的iiPCR 方法配合現(xiàn)場使用的核酸提取試劑盒[21]即可實現(xiàn)ASFV 檢測的現(xiàn)場化，具有很大的應用潛力。

3.2 實現(xiàn)了ASFV 現(xiàn)場檢測的標準化

PCR 是目前我國ASFV 檢測的主要手段。關于該病毒的PCR 檢測方法很多，如普通PCR、熒光PCR 等，但這些PCR 檢測方法均需專業(yè)實驗室，操作過程較為繁瑣，耗時較長[26-28]。且不同方法因檢測靶點、反應體系和條件的不同，導致的特異性、通用性和敏感度等指標有很大差異，對檢測結果具有很大影響。面對ASF 等需要封鎖、撲殺的一類動物疫病，診斷方法的標準化至關重要。本研究建立的ASFV iiPCR 檢測方法的最低檢測限以及對ASFV 陰陽性樣本的檢測結果，均與農業(yè)農村部172 號公告推薦的熒光定量PCR 方法一致，說明本方法能替代推薦的熒光定量PCR 方法，實現(xiàn)對臨床樣本的現(xiàn)場檢測，且速度更快，操作更簡捷，為ASF 診斷提供了可靠的現(xiàn)場診斷新方法。