PRRSV GP5 和M 抗原中和表位的融合表達(dá)與純化以及間接ELISA 檢測(cè)方法的建立

李雷斌，李曉霞，王睿男，周 智，劉玉良，趙柏林，孫 航，馮 冰，陳 玲，王傳彬，李義平，孫 雨

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，國(guó)家/OIE 豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室，北京 102600）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。PRRSV 為動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的成員，是一種有囊膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，病毒粒子直徑為50～65 nm，表面含有纖突[1]。PRRSV 有美洲和歐洲2 個(gè)血清型，我國(guó)分離株主要為美洲型。PRRSV 宿主范圍狹窄，主要感染家豬和野豬，可引起動(dòng)物持續(xù)性感染，抗體依賴(lài)性增強(qiáng)并發(fā)生免疫抑制，導(dǎo)致豬抵抗力下降[2]。患病豬通常表現(xiàn)高熱、呼吸困難、咳嗽、食欲減退、皮膚發(fā)紺，以及妊娠母豬流產(chǎn)、癱瘓，仔豬毛發(fā)粗亂、精神不振、站立不穩(wěn)等臨床癥狀。該病患病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)60%以上。PRRSV 可在豬原代肺泡巨噬細(xì)胞和猴腎細(xì)胞系及樹(shù)突狀細(xì)胞中建立感染[3]。PRRSV 于1987 年在美國(guó)被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，迅速傳遍世界各養(yǎng)豬國(guó)家，在豬群密集、流動(dòng)頻繁的地區(qū)更易流行，常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，該病在國(guó)內(nèi)呈現(xiàn)明顯的高發(fā)趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失，已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。

PRRSV 的基因組RNA 大小為15 kb，具有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端Poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)。該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白為GP2a、GP3、GP4、GP5、M、E（GP2b）、N（圖1），其中GP5 和M 蛋白是PRRSV 的主要囊膜蛋白，它們的總含量占病毒蛋白的一半以上，在病毒粒子表面通過(guò)二硫鍵連接形成異源二聚體[4]。GP5 是一種含有糖基化位點(diǎn)的蛋白，參與細(xì)胞受體識(shí)別和病毒中和；M 是一種非糖基化蛋白，主要參與病毒的組裝，可增強(qiáng)宿主對(duì)GP5 蛋白免疫反應(yīng)，產(chǎn)生較強(qiáng)的中和抗體應(yīng)答，有作為抗原檢測(cè)靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)。此外，GP5 和M 也是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，是基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)靶蛋白。

目前，檢測(cè)PRRSV 常用的血清試驗(yàn)有免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）[5]、間接熒光免疫抗體試驗(yàn)（IFA）[6]、中和試驗(yàn)（SN）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。IPMA 和IFA 是用于檢測(cè)病毒感染后抗體是否表達(dá)的經(jīng)典試驗(yàn)方法，然而兩者主觀性強(qiáng)，易受操作人員技術(shù)和知識(shí)水平影響，操作費(fèi)力，不適合用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)。SN 只能檢測(cè)具有中和作用的抗體，不適用于早期病毒的檢查。而ELISA 特異性強(qiáng)，敏感性高，易于操作。基于以上原因，本研究以目前國(guó)內(nèi)流行的NADC30-Like PRRSV 毒株基因序列為擴(kuò)增模板，全面分析了PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP5 和M 的二級(jí)結(jié)構(gòu)抗原指數(shù)、抗原性、親水性、表面可及性以及潛在中和表位等參數(shù)，選取GP5 與M 蛋白的相應(yīng)中和表位作為免疫原，通過(guò)構(gòu)建帶接頭序列的GP5/M 中和表位融合表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-GP5/M，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)可溶性GP5/M 蛋白，建立了檢測(cè)豬體內(nèi)PRRSV中和抗體的間接ELISA方法，為提高PRRSV 中和抗體檢測(cè)和開(kāi)發(fā)PRRSV GP5/M 亞單位疫苗奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與表達(dá)菌株構(gòu)建

NADC30-Like PRRSV 毒株，由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（國(guó)家/OIE 豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室）分離并保存。通過(guò)對(duì)PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP5 和M 二級(jí)結(jié)構(gòu)序列的抗原指數(shù)、抗原性、親水性、表面可及性、可能中和位點(diǎn)等參數(shù)進(jìn)行分析，分別選取了GP5 的47～61、143～156 和186～199 位氨基酸，M 蛋白的63～70、133～146 和156～169 位氨基酸作為免疫候選抗原，并進(jìn)行序列密碼子篩選優(yōu)化、接頭（linker）序列柔性連接，構(gòu)建中和表位抗原表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-GP5/M。將構(gòu)建好的上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，作為GP5/M 的表達(dá)菌株。

1.2 主要試劑

2×PCR mix buffer、DNA marker，購(gòu)自Promega公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購(gòu)自O(shè)XOID 公司；氨芐青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、X-gal、IPTG、His-tag 抗體、鼠單克隆抗體，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；鎳瓊脂糖凝膠FF，購(gòu)自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒，購(gòu)自Beyotime 公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型），購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。本試驗(yàn)中的PRRSV 陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、相應(yīng)特異性質(zhì)控血清與臨床比對(duì)血清樣本，均經(jīng)過(guò)血清中和試驗(yàn)鑒定，并保存于中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（國(guó)家/OIE 豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)1 對(duì)GP5/M 引物序列（M-F：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；M-R：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'），由北京六合華大基因科技有限公司合成檢測(cè)引物。

1.4 融合蛋白質(zhì)粒表達(dá)

取4 μL pET-32a-GP5/M 轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂板；選取陽(yáng)性質(zhì)粒接種到5 mL 含50 μg/mL 氨芐青霉素LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；將活化菌液按1:100 的比例加到500 mL LB 培養(yǎng)基中（含50 μg/mL 氨芐青霉素）37 ℃震蕩培養(yǎng)；當(dāng)菌液OD600nm值為0.5～0.6 時(shí)，加入終濃度為0.75 mmol/L 的IPTG，16 ℃、180 r/min過(guò)夜誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.5 質(zhì)粒提取及PCR 鑒定

取10 mL 菌液使用小提試劑盒提取質(zhì)粒，具體步驟參照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)。將提取質(zhì)粒、菌液用于PCR 鑒定。PCR 擴(kuò)增體系25.0 μL：2×TaqPCRMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，引物各1.0 μL，模板2.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。程序結(jié)束后，將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余菌液用于離心純化蛋白，將沉淀4 ℃保存。表達(dá)成功后，將其命名為融合GP5/M 表位抗原。

1.6 融合表位抗原SDS-PAGE 鑒定與純化

取出4 ℃保存的沉淀，用10 mL Tris-base 進(jìn)行重懸，超聲破碎菌體；將裂解后的菌體在4 ℃條件下12 000 r/min 離心20 min，取50 μL 離心上清進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色，鑒定融合GP5/M 表位抗原的表達(dá)；將表達(dá)后的融合GP5/M 表位抗原使用6×His 蛋白鎳瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行親和層析純化。

1.7 融合表位抗原質(zhì)量濃度測(cè)定及Western Blotting 鑒定

使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)GP5/M 濃度。BCA 標(biāo)準(zhǔn)品按表1 進(jìn)行稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，OD560nm條件下測(cè)定融合GP5/M 表位抗原的濃度，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取融合GP5/M 表位抗原與2×上樣緩沖液各50 μL 混勻，放置金屬浴100 ℃變性10 min；取30 μL 樣品上樣，12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜，脫脂奶4 ℃封閉過(guò)夜；按稀釋度為1:2 000 孵育對(duì)照血清90 min，TBST洗滌5 次，每次7 min；孵育HRP 標(biāo)記的抗豬二抗60 min，稀釋度為1:20 000，DAB 顯色試劑液顯色。

表1 BCA 蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)稀釋度

1.8 ELISA 檢測(cè)方法的建立

1.8.1 抗原包被濃度確定 將融合GP5/M（原始質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL）表位抗原用pH9.6 碳酸鹽包被液按1:20、1:50、1:100、1:200、1:300、1:600、1:1 200、1:3 000、1:6 000 進(jìn)行稀釋?zhuān)?00 μL/孔加到ELISA 酶標(biāo)板中，37 ℃孵育2 h；用PBST洗滌5 次，5%的脫脂奶250 μL/孔37 ℃封閉2 h，洗滌步驟同上；加入按1:100 稀釋的陽(yáng)性對(duì)照（PRRSV 陽(yáng)性血清）和陰性對(duì)照（SPF 豬血清）各兩孔，37 ℃孵育1 h；用PBST 洗滌，加入按1:20 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的抗HRP 標(biāo)記的抗豬二抗（100 μL/孔），孵育30 min；PBST 洗滌，加顯色液（100 μL/孔）室溫顯色5 min 后加終止液（100 μL/孔），測(cè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照OD450nm值；選取P/N（陽(yáng)性平均值/陰性平均值）最優(yōu)值作為最佳的包被濃度。

1.8.2 封閉及稀釋條件確定 按已經(jīng)確定的抗原包被濃度包被ELISA 酶標(biāo)板，摸索確定封閉液（5%脫脂奶、1%魚(yú)明膠、1%BSA）和稀釋液（5%脫脂奶、1%魚(yú)明膠、0.67%BSA），以棋盤(pán)滴定的方式進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.8.3 血清樣本和HRP 標(biāo)記抗豬二抗最佳稀釋倍數(shù)確定 按上述摸索好的步驟進(jìn)行試驗(yàn)，將對(duì)照血清樣本和HRP 標(biāo)記抗豬二抗稀釋度分別設(shè)置為1:20、1:50、1:100、1:200、1:500，各設(shè)兩個(gè)陰陽(yáng)對(duì)照，OD450nm條件下進(jìn)行檢測(cè)。選取P/N最優(yōu)值作為最佳對(duì)照血清樣本和HRP 抗豬標(biāo)記二抗稀釋倍數(shù)。

1.8.4 血清樣本與HRP 標(biāo)記二抗及底物反應(yīng)時(shí)間確定 在ELISA 酶標(biāo)板中加入陰陽(yáng)對(duì)照各兩孔，將PRRSV 陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清和HRP 標(biāo)記二抗的孵育時(shí)間分別設(shè)置為30、45、60 min，底物顯色時(shí)間分別設(shè)置為5、10、15 min，測(cè)OD450nm值，選取P/N最優(yōu)值確定最佳的PRRSV 陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清和HRP 標(biāo)記二抗及底物孵育時(shí)間。

1.9 ELISA 陰陽(yáng)性臨界值確定

將本實(shí)驗(yàn)室保存的400 份經(jīng)血清中和試驗(yàn)檢測(cè)為陰性的豬血清進(jìn)行間接ELISA 檢測(cè)，計(jì)算該400 份血清的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。當(dāng)OD450nm≥X+3SD 判為陽(yáng)性，OD450nm＜X+3SD 判為陰性。

1.10 試驗(yàn)驗(yàn)證

1.10.1 特異性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA 方法對(duì)豬瘟病毒、O 型口蹄疫病毒、A 型口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬肺炎支原體等其他豬病病原的陽(yáng)性質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè)，觀察PRRSV 與其他病原有無(wú)交叉反應(yīng)。

1.10.2 敏感性試驗(yàn) 將已知的PRRSV 陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)捎媒⒌拈g接ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用血清中和試驗(yàn)作對(duì)比，得出陽(yáng)性臨界值時(shí)的最大稀釋度。

1.10.3 重復(fù)性試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA 方法對(duì)10 份豬血清在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定5 次，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）。

1.10.4 符合性試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA 方法與血清中和試驗(yàn)，對(duì)420 份臨床血清進(jìn)行平行檢測(cè)，計(jì)算符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合表位抗原模式及PCR 鑒定

分別取2 μL 質(zhì)粒和菌液進(jìn)行PCR 鑒定，用水作為陰性對(duì)照。結(jié)果（圖2～3）顯示：菌液和質(zhì)粒均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，條帶位于融合表位抗原相對(duì)分子質(zhì)量大小位置，說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 SDS-PAGE 鑒定

使用IPTG 對(duì)融合表位抗原菌液誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行破碎離心處理，對(duì)上清進(jìn)行SDS-PAGE 分析。結(jié)果（圖4）顯示：上清液有特異性條帶出現(xiàn)，但含有很多雜帶。這表明融合表位抗原沒(méi)有純化，存在較多雜蛋白。

2.3 純化后抗原SDS-PAGE 分析

將離心上清通過(guò)鎳柱純化，收取純化后的洗脫蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分析。結(jié)果（圖5）顯示，融合表位抗原在相應(yīng)分子質(zhì)量大小處出現(xiàn)特異性條帶且純化效率較高。

2.4 BCA 蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

用梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度的結(jié)果（圖6）顯示：GP5/M 抗原原液OD560nm為0.377，代入公式，融合表位抗原質(zhì)量濃度為0.28 mg/mL；將抗原稀釋1 倍，測(cè)得OD560nm為0.326，融合表位抗原質(zhì)量濃度為0.22 mg/mL。取兩者的平均值，即融合表位抗原最終質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。

2.5 融合表位抗原Western Blotting 分析

結(jié)果（圖7）顯示：未純化的GP5/M 上清抗原、純化的GP5/M 上清抗原和溶解的沉淀抗原均與陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶。

2.6 表位抗原ELISA 檢測(cè)方法建立

2.6.1 最佳包被質(zhì)量濃度測(cè)定 結(jié)果（表2）顯示，P/N最優(yōu)值為12.445，此時(shí)抗原的質(zhì)量濃度為50 ng/100 μL，因此將該質(zhì)量濃度設(shè)定為最佳的抗原包被質(zhì)量濃度。

表2 抗原包被質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果

2.6.2 表位抗原封閉液及稀釋液選擇 結(jié)果（表3）顯示，P/N最優(yōu)值為6.348，即確定的封閉液為5%脫脂奶，稀釋液也為5%脫脂奶。

2.6.3 PRRSV 血清樣本稀釋比例確定 結(jié)果（表4）顯示：P/N最優(yōu)值為7.524，即PRRSV 陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清的稀釋比例為1:50。

2.6.4 HRP 標(biāo)記二抗反應(yīng)濃度確定 結(jié)果（表5）顯示：將HRP 標(biāo)記的抗豬二抗稀釋后，P/N最優(yōu)值為6.866，此時(shí)HRP 標(biāo)記的抗豬二抗的稀釋比例為1:10 000。

表5 HRP 標(biāo)記二抗反應(yīng)濃度確定結(jié)果

2.6.5 PRRSV 血清樣本與HRP 標(biāo)記二抗反應(yīng)時(shí)間確定 結(jié)果顯示（表6）：P/N最優(yōu)值為16.763，此時(shí)PRRSV 血清的反應(yīng)時(shí)間為30 min，HRP 標(biāo)記二抗的反應(yīng)時(shí)間為45 min。

表6 PRRSV 對(duì)照血清樣本和HRP 標(biāo)記二抗不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)定結(jié)果（OD 值）

2.6.6 底物顯色時(shí)間確定 結(jié)果（表7）顯示：P/N最優(yōu)值為15.515，即顯色的最佳時(shí)間確定為5 min。

表7 底物顯色時(shí)間確定結(jié)果（OD 值）

2.7 融合GP5/M 表位抗原ELISA 優(yōu)化

經(jīng)過(guò)條件摸索，最終確定ELISA 檢測(cè)條件。包被：用pH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋融合GP5/M 表位抗原包被ELISA 檢測(cè)板（50 ng/孔），每孔加入100 μL，37 ℃孵育2 h；封閉：取出酶標(biāo)板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，每孔加入250 μL 5%脫脂奶，37 ℃封閉2 h；一抗孵育：出酶標(biāo)板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，每孔加入100 μL 按1:50 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽(yáng)性血清，每孔100 μL，置于37 ℃孵育30 min；酶標(biāo)二抗孵育：取出酶標(biāo)板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，加入1:10 000稀釋的酶標(biāo)抗HRP標(biāo)記的抗豬二抗，每孔100 μL，置于37 ℃孵育45 min；顯色：取出酶標(biāo)板，用PBST 洗滌5 次，最后一次拍干，加入100 μL 底物顯色液，在室溫下顯色5 min；終止反應(yīng)：加入終止液，每孔100 μL，檢測(cè)OD450nm值，記錄結(jié)果。

2.8 ELISA 陰陽(yáng)性臨界值確定

采用建立的間接ELISA 檢測(cè)方法，對(duì)400 份豬陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定OD450nm值。400 份陰性血清平均值X為0.174，SD 為0.058，因此陰陽(yáng)性臨界值X+3SD=0.348。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.9.1 特異性試驗(yàn) 采用建立的間接ELISA 方法對(duì)6 種豬源病原（豬瘟病毒、O 型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬肺炎支原體）陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，其OD450nm值分別 為0.174、0.151、0.184、0.193、0.146、0.183，均小于臨界值0.348，表明重組蛋白與這6 種病原的陽(yáng)性血清均無(wú)交叉反應(yīng)，該間接ELISA 方法具有良好的特異性。

2.9.2 敏感性試驗(yàn) 將血清中和試驗(yàn)鑒定的PRRSV 陽(yáng)性對(duì)照血清從1:25 開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)捎弥亟M蛋白作為包被抗原進(jìn)行檢測(cè)，稀釋度為1:12 800 時(shí)仍呈陽(yáng)性，表明該方法敏感性較好。

2.9.3 重復(fù)性試驗(yàn) 以不同效價(jià)血清稀釋50 倍后做平行重復(fù)ELISA 檢測(cè)。結(jié)果顯示（表8）：批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)（CV）為2%～10%，批間重復(fù)變異系數(shù)（CV）小于15%。結(jié)果表明，建立的間接ELISA 檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

表8 間接 ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.9.4 符合性試驗(yàn) 分別采用本研究建立的間接ELISA 檢測(cè)方法與血清中和試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的420 份臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，該間接ELISA 方法檢測(cè)的樣本陽(yáng)性率為52.86%，血清中和試驗(yàn)檢測(cè)的樣本陽(yáng)性率為48.10%，總符合率為95.24%，符合性良好。

3 討論

本研究成功表達(dá)了融合GP5/M 表位抗原。Western Blotting 和BCA 蛋白濃度測(cè)定結(jié)果表明，融合GP5/M表位抗原在原核系統(tǒng)中得到高效表達(dá)。為了快速檢測(cè)PRRSV，利用融合GP5/M 表位抗原制備ELISA 酶標(biāo)板。研究發(fā)現(xiàn)，包被ELISA 酶標(biāo)板時(shí)，融合GP5/M 表位抗原按50 ng/孔作為包被濃度，臨床血清和HRP 標(biāo)記的抗豬二抗分別按1:50 和1:10 000 稀釋?zhuān)R床血清、HRP 標(biāo)記的抗豬二抗、底物顯色時(shí)間分別按30、45、5 min 時(shí)，測(cè)定的OD450nm值最高。將抗原稀釋至5 ng/孔時(shí)，OD450nm值仍具有較高值，使用融合GP5/M 表位抗原作為包被抗原時(shí)，敏感性和特異性較高，說(shuō)明其具有較高的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用潛力。

PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP5 是一種糖基化膜蛋白，可以通過(guò)與宿主細(xì)胞受體相互作用而在病毒侵入過(guò)程中發(fā)揮作用[7]。結(jié)構(gòu)蛋白M 是一種非糖基化膜蛋白，可增強(qiáng)GP5 的中和活性，二者通過(guò)二硫鍵相連形成的異二聚體是病毒感染過(guò)程中不可或缺的一部分。Van 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，GP5/M 糖蛋白復(fù)合體可與唾液酸依賴(lài)的唾液酸黏附素受體結(jié)合，促進(jìn)病毒與細(xì)胞受體的識(shí)別。Jiang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GP5/M 融合蛋白的免疫應(yīng)答水平明顯高于M 蛋白。基于以上，本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的融合GP5/M 表位抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性，能更好地檢測(cè)PRRSV 病毒血清。

自PRRSV 發(fā)現(xiàn)以來(lái)，結(jié)構(gòu)蛋白一直是人們研究的熱點(diǎn)。結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染過(guò)程中起著非常重要的作用——參與宿主細(xì)胞受體的識(shí)別，增強(qiáng)病毒的感染能力，抑制宿主細(xì)胞正常的細(xì)胞免疫和體液免疫。其中，結(jié)構(gòu)蛋白GP5 一直深受研究人員的青睞，主要原因是糖蛋白GP5 是PRRSV 含量最豐富的包膜糖蛋白，也是中和抗體的關(guān)鍵靶點(diǎn)[10]。Wang等[11]利用GP5 包被ELISA 酶標(biāo)板，發(fā)現(xiàn)GP5 是一種良好的診斷抗原，包被的ELISA 具有較高的特異性，與其他豬病原體并無(wú)交叉反應(yīng)。Du 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用PRRSV GP5 制作的疫苗能夠增強(qiáng)宿主細(xì)胞粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)。以上研究主要針對(duì)單一抗原進(jìn)行了試驗(yàn)，只了解了一種抗原的特性。近年來(lái)，很多研究者通過(guò)將兩種或者三種結(jié)構(gòu)蛋白融合起來(lái)，研究融合蛋白的功能及特性。蔣文明等[13]通過(guò)串聯(lián)表達(dá)PRRSV GP3、GP4、GP5 蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)串聯(lián)表達(dá)的病毒蛋白能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。Jiang 等[14]發(fā)現(xiàn)，融合蛋白GP5/M 能與PRRSV 抗血清特異性反應(yīng)，臨床血清中融合蛋白GP5/M 的ELISA 抗體反應(yīng)（OD630nm）與其特異性中和滴度之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分析PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP5和M 的抗原性、親水性等，選取了病毒結(jié)構(gòu)蛋白GP5 和M 序列的優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)使基因序列長(zhǎng)度更小，剔除了病毒中產(chǎn)生免疫逃逸機(jī)制的位點(diǎn)序列，其親水性、空間結(jié)構(gòu)、免疫效果更佳，這些改變提高了其作為ELISA 抗原使用的靈敏度和特異性。此外，對(duì)融合GP5/M 中和表位抗原的認(rèn)識(shí)，為今后研究以GP5/M 為對(duì)象研制亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)PRRSV 中和抗體檢測(cè)的診斷技術(shù)研究較多。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的用于檢測(cè)PRRSV 抗體的試劑盒主要為國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格十分昂貴，且不能準(zhǔn)確檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的中和抗體水平，給基層PRRSV 抗體檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作的開(kāi)展帶來(lái)一定困難。本研究以高濃度可溶性的重組中和表位蛋白作為包被抗原，優(yōu)化建立的間接ELISA 檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性與重復(fù)性，與其他幾種豬源疫病病原的陽(yáng)性血清無(wú)任何交叉反應(yīng)。取陽(yáng)性值較高的豬血清進(jìn)行稀釋后測(cè)定OD450nm值，同時(shí)與血清中和試驗(yàn)做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)符合率達(dá)到95.24%，表明該方法具有較好的敏感性和重復(fù)性，進(jìn)一步完善可成為成熟產(chǎn)品，適用于基層PRRSV免疫效果監(jiān)測(cè)等實(shí)際工作，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值和前景。