鴨源多重耐藥鼠鼻羅氏菌的分離鑒定、耐藥性及耐藥基因檢測

李旭妮，張寧寧，羅玉峰，馮 妍，朱良全，彭小兵，王 楠

（1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2.中國動物疫病預防控制中心，北京 100125）

鼠鼻羅氏菌（Rothia nasimurium）為兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，屬于放線菌屬微球菌科，為條件致病菌[1]。該菌在首次報道時分離自鼠的鼻腔[2]，并因此得名。近年來，研究人員相繼在狗[3]和鵝[4]的臨床病料中分離到鼠鼻羅氏菌。2021 年，Wang 等[5]也報道了山東省某地患病鴨感染該菌。目前關于鼠鼻羅氏菌的致病力以及耐藥分析研究很少，但該菌常常表現出多種常用抗生素高水平耐藥現象[4]，這恰恰是值得研究者關注的問題。

本課題組于2020 年在東北地區某農場的病鴨鼻拭子中分離得到一株細菌，將其命名為DB1 株，通過鑒定確定為鼠鼻羅氏菌。隨后，對分離得到的鼠鼻羅氏菌進行耐藥性分析，并對相關耐藥基因進行檢測，以期對由該菌引起感染的治療和預防起到一定指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源及背景 2020 年東北地區某農場送檢發病鴨多只。病鴨主要表現為散發性呼吸系統癥狀（流黏性鼻液、咳嗽、呼吸急促），進食量減少，精神低沉。通過問詢畜主，得知該農場飼養環境較差，且時處冬末春初，為保持圈舍環境溫度，常關閉門窗，舍內通風差。發病后，畜主投喂了青霉素和板藍根，但治療效果不佳。本課題組研究人員到場后，無菌采集發病鴨鼻拭子進行細菌分離培養。

1.1.2 試劑及藥品 10×Buffer、ExTaq酶、dNTP、切膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態細胞，均購自寶生物工程（大連）有限公司；TSB液體培養基、TSA 培養基、細菌生化微量鑒定管，均購自杭州微生物試劑有限公司；DNA 提取試劑盒，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、多西環素、頭孢氨芐、恩諾沙星8 種抗菌藥物，均購自北京海洋醫藥化工生物科技有限公司。

1.1.3 試驗動物 20 日齡試驗級法國番鴨12 只，雌雄各半，體質量（1.5±0.2）kg，購自東北大學實驗動物中心。

1.2 細菌分離培養

將采集的鼻拭子放置于1 mL 無菌水中，浸泡0.5～2 h，離心收集沉淀；將收集樣品無菌接種TSA 固體培養基，置于37 ℃恒溫培養箱中連續培養24 h；挑取單個菌落接種在TSB 液體培養基中，繼續培養留用。

1.3 涂片鏡檢

用接種環挑取上述培養基中的單個菌落，進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細菌菌落形態特點。

1.4 生化鑒定

將純化后的細菌培養物分別進行葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甲基β-D-吡喃葡萄糖苷、蔗糖、糖原、乳糖、蜜二糖、半乳糖醛酸苷酶、精氨酸二氫酶、堿性磷酸酶等一系列生化試驗，37 ℃培養24 h，觀察結果并記錄。試驗結果參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行比對。

1.5 動物回歸試驗

將12 只法國番鴨隨機分為2 組，每組6 只。一組為試驗組，將菌液在37 ℃條件下培養18～24 h，取5 mL 菌液12 000 r/min 離心10 min，棄上清，在所得沉淀中加入生理鹽水稀釋至原菌液濃度；將所得樣品注射試驗番鴨（3 mL/只），每隔6 h 觀察番鴨的臨床表現，隔離觀察7 d。另一組為對照組，注射無菌生理鹽水（3 mL/只）。

1.6 分離菌株16S rDNA 基因序列測定

用DNA 提取試劑盒提取菌液DNA。使用Primer 6.0 軟件設計16S rDNA 引物（上游引物序列：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3'；下游引物序列：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'），進行PCR 擴增。反應體系：DNA 模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq酶 0.2 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，最后用dd H2O補充至25.0 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。取PCR 擴增產物進行核酸電泳檢測，隨后將得到的PCR 產物切膠回收，連接，轉化，提取質粒，并將純化質粒送往深圳華大基因股份有限公司進行核苷酸序列測定。

1.7 序列比對及系統進化樹構建

為證實親緣關系，將16S rDNA 測序結果與從Amazona aestiva中分離的菌株核酸序列（GenBank登錄號KR059855.1）進行Blast 分析比對，并從NCBI 網站中選取4 株全基因組序列作為分析對象，采用MEGA 5.05 軟件構建系統進化樹。

1.8 藥敏試驗

選用獸醫臨床上較為常見的8 種獸用抗菌藥物，分別為卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、多西環素、頭孢氨芐、恩諾沙星。采用微量稀釋法進行最小抑菌濃度（MIC 值）測定，結果參照美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）公布的標準《動物源性細菌抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執行標準（第四版）VET01-A4》[6]，判定其耐藥情況。

采用常規PCR 檢測兩種耐藥基因（TME和OXA-23），耐藥基因引物及參考文獻見表1。PCR反應體系：DNA 模板4.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq酶 0.3 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，最后以ddH2O 補充至25.0 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增完成后，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 耐藥基因PCR 引物序列及終產物長度

2 結果

2.1 細菌分離培養

如圖1 顯示，細菌在TSA 培養基上生長緩慢，24 h 后，在TSA 固體培養基上生長出淡灰色、圓形、光滑、隆起且邊緣整齊的菌落。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，置于油鏡下觀察，可以發現分離株為革蘭氏陽性球菌，單個或兩兩相連（圖2），將其命名為DB1 株。

2.2 生化鑒定

生化試驗結果（表2）顯示，分離菌株生化特性與鼠鼻羅氏菌基本一致，初步確定該菌為鼠鼻羅氏菌。

表2 菌株DB1 生化特性

2.3 動物回歸試驗

12 只健康番鴨在隔離觀察7 d 無任何異常后，進行動物回歸試驗。結果顯示：試驗組番鴨在注射菌液4 d 后出現明顯癥狀，主要表現為采食量下降，精神萎靡，鼻腔有黏性分泌物流出，所有試驗鴨均無死亡現象；對照組番鴨無任何異常現象。采集發病鴨鼻腔黏性分泌物，進行實驗室分離培養、生化試驗及16S rDNA 基因測序，結果從發病鴨鼻腔黏性分泌物中能夠再次分離到鼠鼻羅氏菌。

2.4 16S rDNA 基因擴增

以提取的DNA 為模板，進行16S rDNA 基因PCR 擴增，擴增產物通過10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果（圖3）顯示，擴增產物核苷酸序列大小約為1 500 bp。在GenBank 數據庫中經Blast比對分析，結果顯示該菌株與鼠鼻羅氏菌相似度為99%。

2.5 系統進化樹構建

使用MEGA 5.05 軟件，將分離菌株DB1 與GenBank 數據庫中鼠鼻羅氏菌其他代表性菌株構建進化樹。結果（圖4）顯示，分離菌株DB1 與鼠鼻羅氏菌NR025310.1 同在一個分支，表明該分離菌株為鼠鼻羅氏菌。

2.6 藥敏試驗

根據各種藥物的濃度測試范圍結果，分析MIC 結果，參照CLSI 臨床標準，得出以下結果（表3）：本試驗分離的鼠鼻羅氏菌DB1 株對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、頭孢氨芐均耐藥，僅對多西環素敏感。

表3 鼠鼻羅氏菌DB1 株肉湯稀釋法藥敏試驗結果 單位：μg/mL

2.7 耐藥基因檢測

對分離菌株DB1 進行β-內酰胺類抗生素耐藥基因（TME和OXA-23）PCR 檢測，TME和OXA-23基因預期擴增片段長度分別為535 和1 067 bp。結果（圖5）顯示，兩種耐藥基因擴增均呈陰性。

3 討論

鼠鼻羅氏菌屬于羅氏菌屬，為兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，不形成孢子，無動力，最早被歸類為放線菌科。2000 年由Collins 等[2]首次發現于鼠的鼻腔，并因此得名。2011 年李楠等[7]在空氣中分離到一株鼠鼻羅氏菌，并確定其為具有高水平多重耐藥表型的分離株。2014 年David 等[3]報道在狗感染部位分離到鼠鼻羅氏菌，表明其作為共生體或者機會性病原體在與葡萄球菌混合感染中產生致病性。2021 年趙巧雅等[8]在患病仔兔的肺臟中分離出一株鼠鼻羅氏菌。迄今為止，在我國東北地區幾乎沒有關于該菌株在禽類中的報道。

從本研究藥敏試驗結果可知，分離菌株DB1對多種藥物耐藥，僅對多西環素敏感。β-內酰胺類抗生素耐藥基因檢測結果為陰性，但分離菌株對該類藥物表現為耐藥，說明該菌產生耐藥性的原因并非耐藥基因，分析原因可能為日常飼養中該類藥物使用較為頻繁，從而導致耐藥性產生。近年來，抗生素濫用現象十分嚴重，細菌耐藥性已經成為科學研究的熱點。多重耐藥菌株的產生，也使人們面臨著嚴峻考驗[9]。到目前為止，世界上發現的高水平耐藥細菌數量呈現增長趨勢，如金黃色葡萄球菌[10]、銅綠假單胞菌[11]、鮑曼不動桿菌[12]等，這些都是臨床上常見的病原菌，而有關高水平耐藥鼠鼻羅氏菌卻報道較少[13-14]。養殖人員在動物患病時，特別是疑似或確診為細菌性感染時，應及時開展藥物敏感性試驗，使用敏感性高的藥物進行針對性治療，做到合理使用，避免抗生素濫用。

本研究從某農場患病鴨的鼻拭子中分離到一株優勢菌，通過分子生物學方法鑒定該菌為鼠鼻羅氏菌。從鴨鼻拭子中分離到鼠鼻羅氏菌在我國東北地區尚屬首次報道。致病性試驗結果顯示，分離菌株對番鴨具有一定致病性。因此，養殖場在防控細菌性疾病時，一方面要加強日常飼養管理，提高動物機體免疫機能，保護易感動物。另一方面，要落實落細清洗、消毒等生物安全防控措施，確保養殖場、圈舍內清潔衛生，切斷細菌性疾病的傳播途徑。此外，在高水平耐藥菌株跨物種傳播趨勢增強的大背景下，需高度重視病原微生物高水平耐藥給養殖業帶來的潛在威脅，貯備和建立有效的監測及防控機制，從而保障畜牧業生產安全和公共衛生安全。