吉西他濱聯(lián)合PD-1單抗對(duì)肺癌小鼠腫瘤體內(nèi)增殖能力的影響*

楊雅萌，羅丹鳳

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建泉州 362011；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九一〇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建泉州 362008)

肺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，有較高的患病率和病死率，嚴(yán)重威脅人類生命健康。根據(jù)國(guó)家癌癥中心2017年公布的最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肺癌發(fā)病率和病死率均位居癌癥第一位[1]。2018年美國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌新發(fā)病例數(shù)在男、女性中均位居第二位，在惡性腫瘤病死率中位居第一位[2-3]。由此可見(jiàn)，肺癌是全球范圍內(nèi)對(duì)人類健康威脅最大的腫瘤。由于在早期沒(méi)有明顯的臨床癥狀和體征，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于晚期。晚期肺癌傳統(tǒng)的治療手段主要包括化療與靶向治療，但療效非常有限。近年來(lái)，免疫治療在腫瘤治療中的價(jià)值引起了大量的關(guān)注，尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑更是在臨床多腫瘤中得到應(yīng)用，其中抗程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)抗體是研究和應(yīng)用最為廣泛的免疫檢查點(diǎn)抑制劑[4-5]。PD-1是一種共刺激分子，屬于B7-CD28超家族成員，通常表達(dá)于活化的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞[6]。PD-1有兩個(gè)配體，PD-L1和PD-L2均表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞上。PD-1與PD-L1或 PD-L2結(jié)合可通過(guò)多種機(jī)制削弱T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞能夠利用這一特點(diǎn)逃避T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用[7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肺癌具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，攜帶大量編碼新抗原的腫瘤突變負(fù)荷[8]。然而，由于腫瘤免疫逃逸的存在，機(jī)體的免疫系統(tǒng)卻無(wú)法將這些腫瘤清除。免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗PD-1/PD-L1抗體的出現(xiàn)為該病的治愈帶來(lái)了希望。雖然抗PD-1抗體治療比化療使患者具有更高的客觀緩解率和更長(zhǎng)的生存時(shí)間，讓部分患者達(dá)到持久緩解，但接受單一的抗PD-1抗體治療的肺癌患者中僅有少數(shù)有效，大部分仍然不能從治療中獲益，還有一部分初始有效后腫瘤還是再次出現(xiàn)。吉西他濱(GEM)為一種新的胞嘧啶核苷衍生物，在臨床上應(yīng)用非常廣泛，是常用的治療非小細(xì)胞肺癌的化療藥物[9-10]。本研究用GEM聯(lián)合抗PD-1抗體對(duì)腫瘤小鼠模型進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其對(duì)腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)所用小鼠均為C57BL/6純系雌性小鼠，共40只，8～10周齡，體重18～21 g，所有小鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002]，小鼠飼養(yǎng)在無(wú)特殊病原體(SPF)環(huán)境中。本實(shí)驗(yàn)符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。本實(shí)驗(yàn)所用Lewis肺癌細(xì)胞系(LCC)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，與C57BL/6純系雌性小鼠具有相同的遺傳背景。

1.1.2儀器與試劑

胎牛血清(貨號(hào)：16000-044)、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：C11995500BT)和胰酶溶液(貨號(hào)：25200-072)，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號(hào)：BF-0011，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)；PD-1抗體(貨號(hào)：BE0146，美國(guó)BioXcell公司)；CD33 PE-Cy7熒光單克隆抗體試劑、CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)；310直熱式5% CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；Lecia DMI1型倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

取復(fù)蘇后適量的LCC接種于100 mL的培養(yǎng)皿中，放入10 mL含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁并覆蓋90%皿底時(shí)棄去培養(yǎng)基，3 mL胰酶溶液消化3 min，5 mL培養(yǎng)基終止消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代。待細(xì)胞狀態(tài)較好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞，使用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，置于冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Lewis動(dòng)物模型建立及分組

取處于對(duì)數(shù)期的LCC，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，用計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種細(xì)胞懸液于小鼠的右大腿上，每只小鼠0.1 mL，并且保證細(xì)胞懸液沒(méi)有滲出，才能確保每只小鼠均有腫瘤形成。10 d后所有小鼠體內(nèi)均有腫瘤形成，當(dāng)腫瘤在體內(nèi)增長(zhǎng)至100～200 mm3，用游標(biāo)尺測(cè)量小鼠腫瘤的體積。采用隨機(jī)數(shù)字法把40只小鼠分為空白對(duì)照組(NC組)、GEM組、PD-1抗體組(PD-1組)和GEM聯(lián)合PD-1抗體組(聯(lián)合組)，每組10只。NC組小鼠腹腔注射200 μL/kg的PBS溶液干預(yù)，GEM組小鼠腹腔注射50 mg/kg GEM溶液干預(yù)治療[11]，PD-1組小鼠腹腔注射PD-1抗體100 μg/kg，聯(lián)合組小鼠腹腔注射50 mg/kg GEM溶液和100 μg/kg PD-1抗體干預(yù)治療[12]，每周2次，共4次。

1.2.3腫瘤生長(zhǎng)體積的測(cè)定

造模后第2天，用游標(biāo)尺測(cè)量小鼠皮下腫瘤的最大長(zhǎng)經(jīng)和短經(jīng)，每2天1次，同時(shí)計(jì)算小鼠體內(nèi)的腫瘤體積均數(shù)，繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4腫瘤生長(zhǎng)抑制率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)14 d后，處死所有小鼠取出腫瘤，測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。抑制率=(對(duì)照組平均瘤體積-治療組平均瘤體積)/對(duì)照組平均瘤體積×100%。

1.2.5腫瘤微血管密度(MVD)

干預(yù)治療后，處死小鼠并取出皮下腫瘤，將新鮮的腫瘤組織用多聚甲醛進(jìn)行固定。固定好的組織經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后，將組織用切片機(jī)制成4 μm石蠟切片，將切片放在顯微鏡下觀察，每張切片取6個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)切片中的微血管數(shù)，并計(jì)算其平均值。

1.2.6TUNEL檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡

處死小鼠后，取出小鼠腫瘤組織并固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后采用乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，采用石蠟切片機(jī)切制成5 μm左右的冠狀切面。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒為凋亡細(xì)胞，在普通光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL染色后細(xì)胞的總數(shù)量，即為凋亡的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)

處死小鼠后，將腫瘤組織取出，用多聚甲醛固定后經(jīng)石蠟包埋，用免疫組織化學(xué)法對(duì)組織中的VEGF表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以上操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最后結(jié)果以VEGF陽(yáng)性所占百分比為標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)取5個(gè)VEGF分布密集的區(qū)域，在高倍顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽(yáng)性VEGF表達(dá)為棕黃色或褐色，陰性VEGF表達(dá)為淡黃色或無(wú)色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況比較

NC組和PD-1組一般情況可見(jiàn)，小鼠飲食、大便均顯示正常，未見(jiàn)小鼠消瘦，但可見(jiàn)皮下脂肪減少；GEM組和聯(lián)合組小鼠均出現(xiàn)一過(guò)性消瘦，皮下脂肪也明顯減少，實(shí)驗(yàn)期間無(wú)小鼠死亡。

2.2 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)體積比較

NC組、PD-1組、GEM組和聯(lián)合組小鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F質(zhì)量=70.72、F體積=163.4，P<0.001)；且PD-1組、GEM組和聯(lián)合組小鼠腫瘤生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。與NC組相比，PD-1組、GEM組和聯(lián)合組小鼠腫瘤質(zhì)量和體積均明顯降低(P<0.05)；且聯(lián)合組小鼠腫瘤質(zhì)量和體積均明顯小于PD-1組和GEM組(P<0.05)，PD-1組和GEM組小鼠腫瘤質(zhì)量和體積無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積比較

a：P<0.05，與NC組比較；b：與PD-1組、GEM組比較。

2.3 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率比較

NC組、PD-1組、GEM組及聯(lián)合組小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為0、(38.1±1.51)%、(32.9±4.11)%、(58.5±3.21)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=813.5,P<0.05)；與NC組相比，PD-1組、GEM組和聯(lián)合組小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率明顯增加(P<0.05)；聯(lián)合組小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率明顯高于PD-1組和GEM組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合組比較。

2.4 各組小鼠腫瘤MVD比較

NC組、PD-1組、GEM組及聯(lián)合組小鼠腫瘤MVD分別為(59.74±5.34)、(45.90±4.51)、(41.88±4.32)、(7.43±1.20)個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=286.3，P<0.001)；與NC組相比，PD-1組、GEM組和聯(lián)合組小鼠腫瘤MVD明顯降低(P<0.05)；聯(lián)合組小鼠腫瘤MVD明顯低于PD-1組和GEM組(P<0.05)，且PD-1組和GEM組小鼠腫瘤MVD無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合組比較。

2.5 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較

NC組、PD-1組、GEM組及聯(lián)合組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為(4.21±1.42)%、(17.35±6.41)%、(17.98±6.23)%、(63.15±9.56)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=153.4，P<0.001)；與NC組相比，PD-1組、GEM組和聯(lián)合組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率均不同程度增加(P<0.05)；聯(lián)合組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比PD-1組和GEM組明顯增加(P<0.05)，PD-1組和GEM組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4、5。

圖4 TUNEL檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率(×200)

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合組比較。

2.6 各組小鼠VEGF表達(dá)比較

NC組、PD-1組、GEM組及聯(lián)合組小鼠腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為(90.21±6.42)%、(82.54±6.31)%、(80.98±6.78)%、(29.76±7.65)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=171.0，P<0.001)；與NC組相比，PD-1組、GEM組和聯(lián)合組小鼠腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率均不同程度降低(P<0.05)；PD-1組和GEM組小鼠腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差異(P>0.05)；與PD-1組、GEM組比較，聯(lián)合組小鼠腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6、7。

圖6 各組免疫組織化學(xué)VEGF陽(yáng)性表達(dá)(×400)

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合組比較。

3 討 論

肺癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率已位居癌癥病死率之首，近年來(lái)肺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，嚴(yán)重威脅人們的健康[11]。其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的70%～80%，且大部分患者確診時(shí)基本處于肺癌晚期。化療是肺癌晚期的主要治療方法，但由于化療藥物的不良反應(yīng)，以及腫瘤患者的血管無(wú)序性可阻礙化療藥物進(jìn)入組織等情況，一定程度上降低了化療藥物的治療效果[12]。

惡性腫瘤的治療目的是能夠清除腫瘤細(xì)胞而又不傷及健康組織。傳統(tǒng)治療如手術(shù)、放療和化療等在殺死腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，會(huì)不可避免地對(duì)機(jī)體正常組織造成損傷，而且缺乏特異性，無(wú)法徹底清除微小殘留病灶或殘存的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致其治愈率低，復(fù)發(fā)率和病死率高。利用免疫系統(tǒng)能夠區(qū)分“自我”與“非我”、正常組織與惡變組織的特點(diǎn)，來(lái)提高治療效率，減少不良反應(yīng)，已被稱為腫瘤治療的第4種模式[13-14]。近年來(lái)，關(guān)于惡性腫瘤的免疫治療研究取得了重大進(jìn)展。其中最為矚目的免疫治療方式是以 PD-1抗體為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑。PD-1是機(jī)體內(nèi)非常重要的免疫檢查點(diǎn)，它可通過(guò)與兩個(gè)配體PD-L1和PD-L2的結(jié)合來(lái)抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，該機(jī)制對(duì)于機(jī)體維持免疫耐受發(fā)揮重要作用，并且在多種實(shí)體瘤中顯示出卓越的抗腫瘤療效[15]。然而，80%的患者單用免疫治療是無(wú)效的(原發(fā)性耐藥)，而且一小部分有效的患者中還會(huì)存在部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)(繼發(fā)性耐藥)。因此原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥是應(yīng)用PD-1抗體治療腫瘤的最大困擾。為了進(jìn)一步提高療效，越來(lái)越多的臨床研究聚焦于聯(lián)合治療，包括與化療藥物聯(lián)合、與抗血管抑制劑聯(lián)合及與其他免疫治療藥物聯(lián)合等[16]。肺癌一線藥物GEM是細(xì)胞周期特異性抗代謝藥物，介導(dǎo)著DNA的合成，和鉑類藥物聯(lián)合使用效果最佳，但仍有一部分患者對(duì)聯(lián)合化療不耐受，這也一定程度地降低了患者的療效[17]。

本文建立肺癌小鼠模型，分別用GEM、PD-1及GEM聯(lián)合PD-1對(duì)肺癌小鼠進(jìn)行干預(yù)治療，腫瘤生長(zhǎng)情況比較結(jié)果顯示，聯(lián)合組小鼠的腫瘤質(zhì)量和體積均小于GEM組和PD-1組，且腫瘤生長(zhǎng)得到了明顯的延緩，腫瘤生長(zhǎng)抑制率明顯升高；但GEM組和PD-1組小鼠的生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異，可見(jiàn)GEM聯(lián)合PD-1可有效延緩腫瘤的生長(zhǎng)，降低腫瘤的質(zhì)量和體積，明顯提高抗腫瘤效應(yīng)。李源等[18]研究發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼聯(lián)合GEM組腫瘤體積、最高標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmax值)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)陽(yáng)性表達(dá)均明顯低于阿帕替尼組和GEM組，阿帕替尼聯(lián)合GEM可對(duì)Lewis肺癌移植瘤產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展至關(guān)重要，早有研究證實(shí)血管的新生可為腫瘤提供一定的營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等。因此，抑制腫瘤血管的生成可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，GEM和PD-1共同干預(yù)的聯(lián)合組小鼠腫瘤MVD均低于PD-1組和GEM組，可見(jiàn)GEM聯(lián)合PD-1可有效抑制血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。劉相良等[19]研究證實(shí)，VEGF靶向藥物貝伐珠單抗注射液可抑制腫瘤血管生成，在腫瘤耐藥后仍然取得較好的臨床療效，可將化療聯(lián)合貝伐珠單抗注射液作為五線化療方案治療肺腺癌肝轉(zhuǎn)移所致的高膽紅素血癥。VEGF是重要的促血管生成因子，能增加血管通透性，促進(jìn)皮內(nèi)細(xì)胞遷移、增生和腫瘤新生血管生成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組小鼠腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于GEM組和PD-1組，但GEM組和PD-1組無(wú)明顯差異，可見(jiàn)GEM和PD-1產(chǎn)生協(xié)同作用，共同抑制腫瘤中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)。有研究表明，阻斷VEGF和VEGF受體可促進(jìn)腫瘤血管結(jié)構(gòu)的正?；?，也可改變腫瘤的微環(huán)境[20]。

綜上所述，GEM聯(lián)合PD-1單抗可發(fā)揮協(xié)同作用抑制肺癌腫瘤的生長(zhǎng)，降低MVD及VEGF的表達(dá)。