miR-27a-3p介導類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖和侵襲的分子機制研究*

李寧寧，雷 蕾，郝冬林，劉 喆，戴冰冰△

(1.大連市中心醫院風濕免疫科，遼寧大連 116083；2.蘇州市中醫醫院風濕免疫科，江蘇蘇州 215008；3.駐馬店市中心醫院風濕免疫科，河南駐馬店 463000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種最常見的炎癥性疾病，全球范圍內發病率約為1%。其主要表現為炎癥、滑膜炎、關節軟骨及骨損傷，且治療效果欠佳，40%～70%的患者最終會發展為殘疾[1]。病程較長的患者除累及關節外，還可出現間質性肺疾病、心血管疾病等多種關節以外表現[2]。目前，對于RA的治療已有針對炎癥和免疫信號通路的免疫療法，雖然這些治療是有效的，但大部分RA患者在脫離藥物后出現病情反復或加重[3]。滑膜炎癥是由固有免疫和適應性免疫細胞浸潤滑膜組織引起的免疫相關疾病，活化的滑膜成纖維細胞(resident synovial fibroblasts，SFs)是RA的主要病理改變[4]。SFs的主要功能是提供滑膜組織結構支持，分泌滑膜液潤滑關節，減少摩擦運動，滋養無血管的軟骨[5]。而在RA的滑膜中，SFs被活化，表現出細胞凋亡減少、遷移和侵襲增強的特征，成為侵襲性血管膜的主要效應細胞，參與RA的炎癥過程[6]。活化態的SFs表現出具有腫瘤細胞樣的侵襲性表型，并通過產生白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6等促炎細胞因子，以及基質金屬蛋白酶和血管生成因子在RA的發展中發揮主要作用[7]。

微RNA(microRNAs，miRs)是一種短鏈的非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，作為轉錄后調節因子，在多種細胞功能中發揮關鍵作用。miRs主要通過與信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(3′-untranslation region，3′UTR)或5′非翻譯區(5′-untranslation region，5′UTR)結合，特異性地抑制mRNA的翻譯或誘導mRNA的降解，以此來沉默靶基因的表達[8]。本研究中發現，類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs)中miR-27a-3p可以通過靶向分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)參與RA的病理生理過程，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

本研究經大連市中心醫院和駐馬店市中心醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》，所有參與者均簽署書面知情同意書。選取2017—2019年于大連市中心醫院和駐馬店市中心醫院行關節手術的RA患者20例獲取滑膜組織標本，男11例，女9例，年齡34～69歲，平均(52±17)歲。所有RA患者均符合美國風濕病學會疾病分類標準[9]。另選取同期于大連市中心醫院和駐馬店市中心醫院行關節置換手術的關節外傷患者10例，獲取對照組標本，男5例，女5例，年齡28～67歲，平均(45±13)歲。所有對照組患者無自身免疫病、傳染病、惡性腫瘤等其他基礎疾病。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及轉染

獲取新鮮滑膜組織，2 h內無菌條件下剪碎，胰蛋白酶2.5 g/L消化2 h，1 000 r/min離心10 min，獲得目的細胞。DMEM培養基(美國Invitrogen公司)加10%胎牛血清(美國Gibco公司)、青霉素和鏈霉素(P/S，美國Gibco公司)，于37 ℃、5% CO2條件下培養細胞，細胞生長約80%時傳代，選取傳代3～8代的RASFs進行試驗。以Lipofectamine 2000為載體將miR-27a-3p類似物(mimic組)、抑制劑(inhibitor組)轉染入細胞(mimic、inhibitor購自上海吉凱基因化學技術公司)，以未處理組為空白對照(NC組)，脂質體組為陰性對照(Liposome組)。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-PCR)

從細胞中分離得到總RNA。使用Super RT cDNA合成試劑盒(日本TAKARA公司)將RNA模板逆轉錄為cDNA。采用特異性引物對miRNA進行RT-PCR檢測。選擇U6作為管家基因。7500 Fast RT-PCR系統(美國Applied Biosystems公司)進行擴增，采用2-ΔΔCt法計算相對表達水平，重復3次。miR-27a-3p的上游引物序列為5′-ATG GTT CGT GGG TTC ACA-3′，下游引物序列為5′-GTG GCT AAG TTC CGA CG-3′；SFRP1的上游引物序列為5′-GGT CTT AGT TCT GGT TGA TTC-3′，下游引物序列為5′-CTG CTC TTC CGT ATT CTG T-3′；U6的上游引物序列為5′-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3′，下游引物序列為5′-CAC TAT TGC GGG CTG C-3′。

1.2.3Western blot

提取總蛋白，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，上海碧云天生物技術有限公司)。隨后，轉移到硝基纖維素膜(美國Millipore公司)。室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后與SFRP1(1∶2 000，美國Proteintech公司)和β-actin(1∶5 000，美國Proteintech公司)一抗孵育過夜。膜洗滌3次，二抗(1∶5 000，美國Proteintech公司)室溫孵育1 h，顯影成像，ImageJ分條帶灰度值。

1.2.4靶基因預測

基于PITA(genie.weizmann.ac.il/)，miRmap(mirmap.ezlab.org/)，microT(microrna.gr/microT)，miRanda(microrna.org/microrna/home.do)，PicTar(pictar.org/)，TargetScan(http://www.targetscan.org/)數據庫預測miR-27a-3p靶基因。

1.2.5熒光素酶報告試驗

設計并合成含有miR-27a-3p結合位點的SFRP1 3′UTR正常片段(WT)及其突變體(MUT)，置于pMIR-REPORT載體的報告基因下游區域，獲得相應的重組質粒。使用Lipofectamine 2000將miR-27a-3p mimics與重組質粒共轉染，48 h后使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測螢光素酶相對活性。

1.2.6Transwell

采用Transwell檢測細胞侵襲能力。Transwell上室預先涂基質膠(美國BD Biosciences公司)，上、下小室分別加入100 μL無血清培養基和600 μL含10%胎牛血清的培養基。細胞接種于上室，在37 ℃孵育24 h。用棉簽從小室的上表面去除未遷移的細胞。遷移的細胞用0.1%的結晶紫染色，IX81數字顯微鏡(日本Olympus公司)計數。

1.2.7細胞增殖檢測試驗

依據細胞計數試劑盒8(CCK-8)系統(日本Dojindo公司)測定細胞活力。細胞接種在96孔板中(每孔1×104個細胞)。細胞于37 ℃黑暗孵育，于0、24、48、72 h分別加入10 μL CCK-8溶液，再孵育1 h。然后使用酶標儀(瑞士Tecan公司)在450 nm處測定每個孔的吸光度(A450)值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 miR-27a-3p在RASFs細胞中過表達

在獲取RASFs和SFs后，首先通過RT-PCR檢測miR-27a-3p在兩種細胞中的表達。與SFs中的表達水平(1.00±0.21)比較，miR-27a-3p在RASFs中表達水平(3.24±0.45，P<0.05)升高，見圖1A。隨后通過Lipofectamine 2000將miR-27a-3p抑制劑轉染入RASFs，共分3組：未處理的RASFs(NC組)，空脂質體轉入細胞(Liposome組)，脂質體攜帶miR-27a-3p抑制劑轉入細胞(inhibitor組)。同NC組比較，Liposome組中miR-27a-3p表達水平無明顯變化(0.05)，而inhibitor組miR-27a-3p表達水平明顯下降(P<0.05)，見圖1B。

A：miR-27a-3p在RASFs中過表達；B：miR-27a-3p抑制劑抑制miR-27a-3p表達；a：P<0.05。

2.2 miR-27a-3p抑制SFRP1表達

通過PITA，miRmap，microT，miRanda，PicTar，TargetScan數據庫對miR-27a-3p可能結合的靶基因進行預測。預測結果顯示，分泌型卷曲相關蛋白(SFRPs)家族成員SFRP1可能是miR-27a-3p的潛在靶基因，見圖2A。雙熒光素酶報告試驗顯示，與SFRP1-3′UTR-WT NC組相比，miR-27a-3p mimics與SFRP1-3′UTR-WT共轉染使熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見圖2B；而miR-27a-3p mimics與SFRP1-3′UTR-MUT共轉染后熒光素酶的活性無明顯變化(P>0.05)，見圖2B。Western blot顯示，SFRP1在RASFs中表達低于其在SFs中表達(P<0.05)，見圖2C。抑制RASFs中miR-27a-3p表達后，SFRP1的表達水平明顯升高(P<0.05)，見圖2D。SFRP1的siRNA能夠抑制SFRP1的表達(P<0.05)，見圖3。

A：miR-27a-3p與SFRP1的靶向關系；B：雙熒光素酶報告基因試驗證實靶向關系；C：Western blot檢測SFRP1蛋白表達；D：抑制RASFs中miR-27a-3p表達后SFRP1表達增加；a：P<0.05。

a：P<0.05。

2.3 miR-27a-3p和SFRP1影響RASFs侵襲

Transwell試驗中，將miR-27a-3p抑制劑轉染RASFs后，穿膜細胞數量從(179±14)個減少到(124±8)個；而在此基礎上同時轉染si-SFRP1，穿膜細胞數量增加到(155±11)個(P<0.05)，見圖4。

A：細胞侵襲檢測圖(Transwell，×100)；B：轉染后穿膜細胞柱狀圖；a：P<0.05。

2.4 miR-27a-3p和SFRP1影響RASFs增殖

采用CCK-8細胞增殖檢測試驗評估miR-27a-3p和SFRP1對細胞增殖的影響。在RASFs中抑制miR-27a-3p的表達后，細胞增殖減少，而同時抑制SFRP1后細胞增殖增加(P<0.05)，見圖5。

a：P<0.05。

3 討 論

RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，可導致關節滑膜組織的慢性炎癥，進而發展為不可逆的關節破壞，包括滑膜增生、關節腫脹、疼痛、關節炎癥和侵襲，以及軟骨和滑膜損傷等[10]。與惡性腫瘤細胞類似，RASFs具有內在的能力來抵抗微環境中氧自由基和其他有毒代謝物的攻擊[11]。因此，RASFs生物學功能及表型的改變，可促進滑膜血管膜的形成并侵犯鄰近的軟骨和骨組織，這是RA形成的關鍵。現有的RA治療藥物可能不直接針對紊亂的RASFs細胞表型，導致對該類患者的治療有效性不足。RASFs的具體激活機制尚不清楚，但近期研究發現Wnt/catenin通路可能參與了RASFs的激活和RA的發生[12]。

SFRPs是Wnt抑制劑，能夠在細胞外與Wnts結合[13]。有報道顯示，SFRP1與炎性反應相關，并在RASFs中表達下降[14]。此外，啟動子超甲基化引起的SFRP1下調可以激活Wnt/catenin信號通路，降低DNA甲基轉移酶1(DNMT1)表達，參與誘導瘢痕疙瘩發育[15]。既往研究報道，miRs可調節免疫反應，參與免疫細胞的增殖、分化，以及某些組織損傷過程[16]。如miR-146a可能是治療RA的新靶點[17]，miR-125b是評估類風濕性關節炎對利妥昔單抗治療反應的潛在生物標志物[18]。

本研究發現，miR-27a-3p在RASFs中過表達，miR-27a-3p可以靶向作用于SFRP1的3′UTR，抑制SFRP1的表達。在RASFs中抑制miR-27a-3p的表達后，細胞的增殖和侵襲能力減弱，而在此基礎上同時抑制SFRP1的表達，細胞的增殖和侵襲能力恢復，提示miR-27a-3p促RA發生、發展的作用是通過抑制SFRP1表達實現的。在一項阿達木單抗聯合氨甲蝶呤治療RA的臨床試驗中發現，治療前后血液中miR-27a-3p的表達變化同RA的緩解密切相關[19]。此外，在乳腺癌中過表達的miR-27a-3p參與腫瘤對阿霉素的化療耐藥[20]，過表達的miR-27a-3p參與糖尿病腎病腎纖維化[21]等。

綜上所述，miR-27a-3p在RASFs中過表達，促進RASFs的侵襲和增殖，而該功能可能是miR-27a-3p通過抑制SFRP1的表達而實現的。但miR-27a-3p/SFRP1軸的上、下游調控關系仍需在后續研究中進一步探討，該系列研究的順利實施，有望成為RA靶向治療的有效靶點。