基于全內反射顯微鏡的熒光漂白后恢復實驗方法建立＊

曹慧珍，王瑾瑜，王文娟

（清華大學生物醫學測試中心尼康生物影像中心，北京100084）

全內反射熒光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）特異性地照亮蓋玻片/樣品界面附近的熒光團，抑制來自細胞更深層的背景[1-2]，廣泛應用于質膜附近的生物過程研究中，例如細胞粘附位點、囊泡胞吐和內吞作用或內質網/質膜接觸位點等[3-4]。熒光漂白后恢復（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）技術是研究分子遷移特性的技術。基于全內反射顯微鏡的熒光漂白后恢復實驗（Total Internal Reflection/Fluorescence Recovery After Photobleaching，IR/FRAP）將TIRFM和FRAP技術相結合，測量蓋玻片/樣品界面分子的動力學數據，是研究質膜附近分子動力學的有力工具[5]。

但是目前商品化設備的TIRFM標準配置不能很好地進行TIR/FRAP實驗。在TIRF顯微鏡上進行FRAP實驗的通用方案是TIRF狀態下使用強光對整個成像區域進行光漂白，使用低強度的光照采集漂白前后的TIRF圖像[4，6-11]。這種實驗方法對于研究體外蛋白質分子或人工膜的動力學是可行的，漂白視野即成像視野僅占整個體系的極少的一部分[8]，符合通用FRAP結果擬合分析中漂白區域是整個體系一部分的假設[12]。但是對于細胞來說，每個細胞是相對獨立的，即每個細胞可以成為獨立的體系，漂白整個細胞后，無法觀察到二維平面的分子運動情況；另外，細胞的被漂白區域太大也很可能會對細胞造成光損傷，影響細胞狀態，獲取錯誤的實驗結果。此外FRAP實驗中，圖像采集過程也存在光漂白，在成像視野中需選擇未漂白的區域作為參考區域分析，可以很容易地校正這種成像中光漂白對FRAP結果的干擾，更方便快捷地獲取準確的樣品動力學數據。因此，發展能夠進行感興趣區域特異性漂白的基于全內反射成像的熒光漂白后恢復技術對于研究細胞質膜的分子動力過程有著非常重要的作用。

基于本平臺的成像設備提出了一種TIR/FRAP技術的實驗方法，可以僅漂白多個任意位置的感興趣區域（ROI），并采集漂白前后TIRF圖像。

1 實驗方法

采用一臺搭載了TIRF照明系統和sCMOS相機（Humamatsu Flash 4.0）的NikonA1R激光掃描共聚焦顯微鏡分別進行共聚焦和TIRF實驗，實驗流程如圖1所示（通過分析虛線框中熒光漂白前后的成像數據就可以得到FRAP曲線）。首先在全內反射成像（TIRF）模式下進行全內反射成像，再切換到共聚焦模式對ROI進行局部光漂白，然后切換到TIRF模式式采集漂白前后全內反射圖像。通過分析熒光漂白前后的TIRF圖像就可以得到FRAP曲線。通過編輯NIS-Elements軟件程序實現TIRF和共聚焦（Confocal）模式間的快速穩定切換，完成TIR/FRAP實驗，獲得質膜附近分子動力學數據。

圖1 基于全內反射成像的熒光漂白后恢復技術的實現路徑

為了滿足TIR/FRAP的實驗需求，對儀器的成像程序進行了一系列的調整，具體實驗流程如下：①打開NIS-Elements成像軟件時，選擇雙驅動模式，同時打開Nikon confocal和Hamamatsu相機的驅動。②確認軟件和硬件的關聯，建立共聚焦和TIRF成像的OC（Optical Configurations，光學配置）。可以一鍵式地切換光學配置，節約實驗時間，減少人工操作錯誤率，簡化并優化成像操作。以TIRF488 OC為例，該光學配置能快速切換儀器狀態到488 nm激光激發下采用相機成像的TIRF成像模式。③根據樣品熒光信號的強弱和穩定性，優化OC中的成像參數，如共聚焦模式中的漂白激光強度和漂白時間，TIRF模式中的激光強度和曝光時間等。④搭建可以實現驅動自動切換的軟件程序，完成TIR/FRAP實驗。

2 自動切換程序

為了尋找合適的快速穩定切換程序，使用NIS-Elements軟件編輯了3種不同類型的軟件程序。它們分別基于ND Sequence Acquisition、Macro和JOBs程序，均可以實現共聚焦模式和TIRF模式間的自動往復切換。

2.1 基于ND Sequence Acquisition的程序

ND Sequence Acquisition是NIS-Elements軟件的一個控制窗口，它可以定義任意多維圖像序列的獲取，還可以選擇在實驗期間運行宏或命令。利用ND Sequence Acquisition將TIRF圖像采集、ROI區域漂白、Laser interlock解鎖、開啟激光等步驟按照一定順序連接起來，即可完成TIR/FRAP實驗。具體程序如圖2所示，即：①切換OC至TIRF488。②執行命令，Stg_RemoveInterlock()，解除激光鎖。③執行命令、Stg_SetShutterStateEx(“488 nm”，1)，打開488 nm的激光光閘。①～③步即可成功切換至TIRF OC，并保證出光可以正常進行圖像采集，隨后即可進行TIRF模式的圖像采集，時間序列、多點序列或多色圖像采集。④ND Acquisition，采集TIRF時間序列圖像，獲取漂白前的TIRF圖像。⑤切換OC至A1，此光學配置快速將儀器切換到共聚焦成像模式。⑥執行命令，Stg_RemoveInterlock()，解除激光鎖。⑦Action選擇Seg.Stimulation，執行共聚焦模式下光刺激實驗。④～⑤步即可成功切換至A1 OC，并保證出光可以正常進行圖像采集，隨后除執行光刺激程序，還可以采集共聚焦圖像，時間序列、多點序列、三維序列等多維圖像，獲取目的蛋白在細胞中其他位置的定位信息。⑧⑦～⑧步重復①～③步的程序，成功切換至TIRF OC。⑨NDAcquisition，采集TIRF時間序列圖像，獲取漂白后的TIRF圖像。

圖2 基于ND Sequence Acquisition的TIR/FRAP程序

2.2 基于Macro的程序

Macro（宏）是計算機語言的一種指令形式，可以組合多個命令，使一系列復雜任務可以自動執行。在Macro中編輯命令，可以實現TIRF和Confocal的自動切換，完成TIR/FRAP實驗。

詳細代碼如下：

SelectOptConf("TIRF488");

Stg_RemoveInterlock();

Stg_SetShutterStateEx("488nm",1);

ND_RunExperiment(1);

SelectOptConf("CONFOCAL-FRAP");

Stg_RemoveInterlock();

ND_RunSequentialStimulationExp();

SelectOptConf("TIRF488");

Stg_RemoveInterlock();

Stg_SetShutterStateEx("488nm",1);

ND_AppendTimePhase(5000,300000,"");

ND_RunExperiment(1);

2.3 基于JOBs的程序

在NIS-Elements 4.60以上的軟件版本中提供了JOBs插件。JOBs為用戶提供了輕松創建復雜的、完全定制實驗模板的功能，支持智能工作流程，將不同類型的圖像拍攝自動結合。JOBs用于TIR/FRAP程序，如圖3所示。

圖3 基于JOBs的TIR/FRAP程序

3 系統測試結果

使用細胞進行測試，上述程序或手動切換均可以完成TIR/FRAP實驗，如圖4所示，獲取任意ROI漂白前后的全內反射圖像。從測試結果中可以看出，手動進行TIRF和Confocal模式的切換時，漂白后恢復TIRF圖像（D4）的采集時間比漂白后Confocal圖像（D3）滯后20 s，漂白區域內的熒光信號強度相對圖D/H/L有明顯的恢復。因此，手動切換可能會獲取不準確的光漂白數據，在樣品的恢復速度較快的情況下，還可能會錯失關鍵數據。3種自動切換程序均可以在比較快的時間（15 s）內實現Confocal和TIRF模式的切換。測試細胞由清華大學俞立課題組提供，是表達TSPAN4-GFP的NRK細胞系[13]。

圖4 TIR/FRAP實驗結果

多次測試后統計發現，手動由TIRF模式切換至共聚焦模式需要（15.11±5.69）s（n＞6），JOBS程序需要（7.49±1.66）s（n＞6），Macro需要（8.76±0.71）s（n＞6），NDSequenceAcquisition程序需要（7.33±0.78）s（n＞10）；手動由共聚焦模式切換至TIRF模式需要（21.07±3.36）s（n＞6），JOBS程序需要（9.02±0.37）s（n＞6），Macro需要（12.33±0.70）s（n＞6），NDSequence Acquisition程序需要（10.84±0.81）s（n＞10）。

從圖4可以看出，A1～A4基于JOBs程序，B1～B4基于Macro程序，C1～C4基于ND sequence Acquisition程序，D1～D4手動切換TIRF和Confocal模式進行TIR/FRAP實驗。第一列是漂白前的TIRF圖像；第二列是漂白前的共聚焦圖像，已完成TIRF至Confocal的切換；第三列是漂白后的共聚焦圖像；第四列是漂白后的TIRF圖像，已完成Confocal至TIRF的切換。標尺，10μm；圖中圓形區域指示漂白區域。E表示TIRF切換至Confocal所需要的時間，F表示Confocal切換至TIRF所需要的時間。

與手動進行模式間的切換相比，自動切換在速度和穩定性方面都具有明顯的優勢。整個TIR/FRAP實驗中存在2次模式間的切換，第一次將TIRF模式切換至Confocal模式，第二次將Confocal切換至TIRF，后者較復雜，需要更長的切換時間，基于JOBs的切換程序可以提供更快且穩定的切換速度，是TIR/FRAP實驗的較優選擇，但這一功能并非NIS-Elements軟件的基礎功能，需要額外購買，且軟件版本需要高于4.60。從模式間切換的速度和穩定性上來看，ND Sequence Acquisition程序也是不錯的選擇，而且ND Sequence Acquisition程序可以自動完成3段數據的拼接，操作簡單。Macro程序雖然速度和穩定性略差于前者，但其對軟件配置和版本沒有要求，是通用型的程序。

4 討論

TIR/FRAP技術在20世紀80年代開始于科學研究中，早期使用光電倍增管而非相機采集漂白前后的熒光數據，僅獲取交界面表面蛋白的動力學數據，沒有空間分辨率數據[8，14]。2000年，桑德將TIR/FRAP技術用于成像領域，既采集空間分辨率的圖像也獲取動力學數據，而且相互印證，動力學數據更加準確[5]，但漂白區域為整個視野，不適用精細定位的蛋白質信號。近些年，有一些實驗室會搭建TIRF-近場顯微鏡，可以在TIRF和近場顯微鏡間自由切換，使用分光器或多型聚光鏡實現ROI區域內的TIR/FRAP實驗[15-17]，但這個ROI只能設定一個且位置大多局限在視野中間[18]。儀器的搭建需要專業的光學工程師，不適用于大多數的實驗室。隨著商品化技術的發展，有一些廠家可以提供獨立的FRAP模塊安裝在TIRF顯微鏡上[19]，可以實現任意ROI區域的光漂白，但這些模塊通常只包含一根激光器，不能滿足使用最佳激發激光進行光漂白實驗的需求，另外一方面也需要額外的經濟和時間成本，以滿足實驗需求。

作為儀器平臺的工作人員，希望及時高效地滿足用戶的實驗需求。本文中TIR/FRAP程序很好地解決了用戶在全內反射成像條件下實現特異性光漂白的熒光漂白后恢復實驗的需求。當然本方法也有一定的局限性，例如不適用于快速恢復的樣品（熒光漂白后恢復時間小于40 s），但是無需購置新的設備和等待漫長的訂貨周期，可以輕松實現漂白多個任意位置ROI，并采集漂白前后全內反射圖像，直接滿足大多數的TIR/FRAP實驗需求，操作也比較簡單。

TIR/FRAP實驗的成功進行，也為TIRF和共聚焦顯微鏡聯合使用提供了基礎。激光共聚焦和全內反射顯微鏡聯合使用可以發揮各自設備的特點，并兼取二者之長，使其相輔相成，更好地應用于科學研究中。