miR-30a-3p/OCT-1調控肝細胞癌的分子機制研究

賀松琴，陳瀟，李因茵，榮光華，葉映泉，聞炳基，羅家玉

目前，肝細胞癌（HCC）抗腫瘤藥物治療的主要策略是使用分子靶向藥物（MTAs），其中索拉非尼（Sorafenib）在臨床已得到廣泛應用，但患者普遍存在明顯耐藥及較嚴重的毒副反應[1]。目前全球各種新型的分子靶向藥物，如瑞戈非尼（Regorafenib）、侖伐替尼/樂伐替尼（Lenvatinib）以及卡博替尼（Cabozantinib）等均批準用于進展期HCC治療[2]。這些藥物與Sorafenib均有相同的化學機構母核{1-[4-（pyridin-4-yloxy）phenyl]urea}，臨床易出現(xiàn)與Sorafenib類似的耐藥現(xiàn)象或毒副反應。

轉錄因子OCT-1是Pit-Oct-Unc（POU）轉錄因子家族的重要成員，能夠通過與八聚體序列（AGTCAAAT）基序（motif）結合，介導其下游基因的轉錄，在包括HCC在內的惡性腫瘤細胞轉移與侵襲等重要生理過程中發(fā)揮了重要作用[3]。microRNA是一類由RNA聚合酶II（RNAPol II）轉錄的小分子非編碼RNA，能夠通過序列特異的方式作用于目標基因的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）降解目的基因的mRNA，最終誘導特定基因的表達沉默[4]。因此，利用微小RNA（miR）的表達載體特異性沉默癌基因的表達是有效的抗腫瘤治療策略[5]。為此，本研究首先使用在線生物信息學工具預測可能作用于OCT-1的miR-30a-3p，再利用化學合成的方法構建pre-miR-30a-3p的慢病毒表達載體，在此基礎上制備包括pre-miR-30a-3p全序列的慢病毒，檢測miR-30a-3p對HCC細胞中OCT-1的影響以及對HCC細胞轉移與耐藥的調控作用。報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料與實驗設備（1）細胞株及細胞培養(yǎng)耗材：高侵襲性HCC細胞系MHCC97-H（中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所細胞中心）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）等為美國Thermo公司產品；60及90 mm直徑細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)瓶及6孔、96孔細胞培養(yǎng)板，均為美國Corning公司產品；預裝-預滅菌的移液器吸頭（包括1000-200、200-20以及1～20l量程）均為美國Axygen公司產品；Transwell培養(yǎng)板、小室為美國Corning公司產品；陽離子脂質體轉染試劑為美國Thermo公司產品。（2）試劑盒：RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及定量PCR試劑盒等均為美國ABI公司產品；分子生物學使用的各類載體均購買自山東維真公司（Vigene）；載體構建實驗使用的各種工具酶類，包括限定性內切酶和DNA鏈接酶為英國NEB公司產品。（3）實驗動物：4～6周齡的胸腺缺失（T細胞缺失）的免疫缺陷小鼠購買自北京斯貝福公司，在SPF清潔條件下進行飼養(yǎng)；60Co-預照射滅菌的鼠糧、墊料等購買自軍事科學院軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心；其余動物手術使用的各式器材，包括針持、縫合針、縫合線、粘鼠板、超凈手術工作臺等均為國產常規(guī)器材。細胞培養(yǎng)實驗使用的恒溫恒濕CO2細胞培養(yǎng)箱為Thermo公司產品；細胞觀察實驗使用的倒置相差顯微鏡為日本尼康公司產品；定量聚合酶鏈式反應（qPCR）實驗使用的實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品（ABI7500）；系列量程的移液器為德國Eppendorf公司產品；其余設備，包括臺式離心機、冰箱等均為國產常規(guī)設備；液相色譜-質譜聯(lián)用平臺為中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所公共實驗平臺保障與提供。

1.2 研究方法

1.2.1 miR預測與載體構建 查詢可知OCT1的Gene Symbol為POU2F1，使用在線工具miRDB對作用于POU2F1的miRs進行預測，結合預測評分和人工判讀即選取評分最高的miR：miR-30a-3p為OCT-1的調控分子。在此基礎上在NCBI數據庫中檢索得到hsa-pre-miR-30a-3p的全序列，通過化學合成的方法獲得包含有半酶切位點的miR-30a-3p的正義與反義序列，二者使用PCR以獲得雙鏈DNA片段。在此基礎上依據has-pre-miR-30a-3p的半酶切位點對慢病毒載體（pLV）進行酶切后與所獲得的miR-30a-3p進行連接，最終獲得miR-30a-3p的慢病毒載體并包裝獲得miR-30a-3p的慢病毒顆粒；將包含有野生型的OCT-1全序列或突變的miR-30a-3p作用位點的OCT-1全序列克隆至pLV載體上，再包裝為慢病毒顆粒。

1.2.2 定量PCR實驗 依據Liang等[6]方法實驗，在MHCC97-H細胞中分別轉染對照組、miR-30a-3p以及miR-30a-3p+OCT-1Mut后，收集MHCC97-H細胞提取總RNA樣品，對樣品進行逆轉錄并進行qPCR檢測。以目標基因相對于內參基因（-Actin）的表達水平計算相對表達水平。（1）OCT-1正向引物5’-GAAACGCACCAGCATAGAGACC-3’，反向引物

5’-GGCGGTTACAGAACCAAACACG-3’；（2）Cyclin D1（ccnd1）正向引物5’-TCTACACCGACAA CTCCATCCG-3’，反向引物5’-TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG-3’；（3）abcb1正向引物5’-GCTGTCAAGGAAGCCAATGCCT-3’，反向引物5’-TGCAATGGCGATCCTCTGCTTC-3’；（4）abcg2正向引物5’-GTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTT-3’，反向引物5’-TCCTCCAGA CACACCACGGATA-3’；（5）snail正 向 引 物 5’-TCAGACGAGGACAGTGGGAAAG-3’，反向引物5’-GCTTGTGGAGCAGGGACATTC-3’；（6）twist正 向 引 物5’-GTACATCGACTTC CTCTACCAG-3’，反向引物5’-CATCCTCCAGACCGAGAAG-3’；（7）內參-actin正向引物5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，反向引物5’-AGGTCTTTGCGGAT GTCCACGT-3’。

1.2.3 Transwell實驗 依據Fan等[4]方法實驗，在MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后，再使用不含有血清的DMEM培養(yǎng)基收集細胞并重懸細胞制備為細胞懸液，再將制備所得的細胞懸液細胞接種于Transwell板的小室中（每孔接種約20 000個細胞）。在這一過程中（即Transwell實驗），對于轉移實驗，細胞懸液直接接種在Transwell板的小室中；對于侵襲實驗，首先在小室中預鋪一層ECM膠模擬組織的基底膜，再將MHCC97-H細胞懸液接種在小室中。此后，在Transwell板外室（即24孔板）中加入含有10%FBS的DMEM后孵育小室（即將前述添加有細胞懸液的Transwell細胞小室放入到24孔板中，使小室底部浸潤在24孔板內容納的包含有10%FBS的DMEM中；侵襲實驗在37℃孵育14～16 h；轉移實驗在37℃孵育6～8 h），此后以結晶紫試劑（0.5%w/v）對單克隆進行染色。

1.2.4 細胞單集落形成實驗 依據Feng等[7]方法實驗，在MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后收集細胞，將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。經過3～4周的生長，MHCC97-H細胞能夠形成單克隆，此時使用結晶紫試劑（0.5%w/v）對單克隆進行染色，使用Image J軟件對單克隆的照片進行定量分析，依據克隆總面積相對于6孔板孔的總面積確定各組克隆的數量，再依據對照組為單位1計算相對克隆數量。

1.2.5 MTT實驗 依據Chen等[8]方法實驗，MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后再收集細胞，使用系列劑量的分子靶向藥物處理細胞約48 h，此后細胞中添加50 mmol/L的MTT試劑，孵育4～6 h后棄去培養(yǎng)基以10%SDS裂解細胞裂解液在490 nm處讀取吸光度值，依據O.D.490 nm計算藥物作用的抑制率，并依據抑制率計算藥物作用的半數抑制率（IC50值）。

1.2.6 藥物代謝與清除檢測實驗 依據Feng等[9]方法實驗，MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后再以1mol/L劑量的Sorafenib處理細胞約12 h，此后棄去培養(yǎng)基上清換成正常DMEM培養(yǎng)基，在系列時間點（0、4、8、12、24、48及72 h時點）收集細胞樣品進行超聲破碎，再使用有機溶劑（乙腈）將細胞樣品中的Sorafenib萃取出來，再使用液相色譜、質譜聯(lián)用技術檢測系列時間點細胞樣品中Sorafenib的含量并計算藥物在MHCC97-H細胞中的半衰期。

1.3 統(tǒng)計分析 數據采用SPSS 9.0軟件分析，計量資料采用Bonferroni校正行方差分析，使用Origin統(tǒng)計分析軟件確定藥物作用于細胞的半數作用濃度（IC50 values）或藥物在細胞中的存留的半衰期。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR抑制其表達 在OCT-1的3’UTR區(qū)域存在兩個miR-30a-3p的作用位點；miR-30a-3p能夠下調MHCC97-H細胞中OCT-1的mRNA表達水平；miR-30a-3p不能夠抑制3’UTR區(qū)域中miR-30a-3p作用位點突變的OCT-1，此時在MHCC97-H細胞中轉染OCT-1突變體，能夠恢復細胞中OCT-1的表達。見封二彩圖1。

圖1 miR-30a-3p作用于OCT-13’UTR的位點序列信息

miR-30a-3p能夠下調OCT-1下游基因的表達水平，其中包括：（1）下調細胞增殖相關基因Cyclin D1表達（P＜0.05）；（2）下調細胞轉移與侵襲相關基因Snail和Twist（均P＜0.05）；（3）下調細胞耐藥相關基因ABCB1/MDR-1以及ABCG2/BRCP等（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-30-3p下調OCT-1及其下游基因的表達水平

2.2 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR抑制MHCC97-H細胞的轉移與侵襲 在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p能夠抑制MHCC97-H細胞的體外轉移與侵襲作用，同時在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p的同時轉染OCT-1的突變體則能夠抑制miR-30a-3p的作用。見封二彩圖2a～b。

圖2 miR-30a-3p抑制MHCC97-H細胞的轉移與侵襲作用

MHCC97-H細胞能夠突破裸鼠肝包膜進而侵襲進入裸鼠肝臟。在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p能夠抑制MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟臟器的侵襲作用，而在MHCC97-H細胞中同時轉染OCT-1突變體則能夠抑制miR-30a-3p對于MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟原位侵襲作用的抗腫瘤活性。見封二彩圖2a、c。

2.3 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR上調MHCC97-H細胞對分子靶向藥Sorafenib的敏感性

在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p能夠顯著延緩Sorafenib在MHCC97-H細胞中的代謝與清除作用，Sorafenib的半衰期顯著延長：對照組為（25.31±7.99）h，miR-30a-3p組為（43.02±6.67）h。而在MHCC97-H細胞中轉染OCT-1突變體則能夠抑制miR-30a-3p的作用：miR-30a-3p+OCT-1Mut組Sorafenib的半衰期為（20.55±10.75）h。

圖3 miR-30a-3p能夠上調Sorafenib對MHCC97-H細胞的殺傷作用

3 討論

受診療技術的限制，HCC患者往往初診即為進展期。由于進展期HCC具有對傳統(tǒng)細胞毒性化療藥物多藥耐藥的特性，因此常見化療藥物如阿霉素等在HCC治療中少有應用，僅能夠應用于經肝動脈化療栓塞（TACE）等少數特殊治療策略。因此分子靶向治療在HCC治療中具有重要意義。盡管有大量臨床試驗進行了相關研究，但仍然僅有Sorafenib等4種分子靶向藥物最終獲批上市用于進展期HCC患者治療，這些藥物的作用機制類似，都是作用于VEGFR、PDGFR以及Raf等受體酪氨酸蛋白激酶蛋白以及下游MAPK等信號通路最終抑制HCC細胞的增殖、轉移、侵襲以及腫瘤血管生成作用[10]。其他藥物，包括曲妥珠單抗等都沒能通過臨床試驗。研究和開發(fā)新的治療和干預靶標成為現(xiàn)階段亟需解決的問題。

本研究闡明了miR-30a-3p/OCT-1在HCC中的作用，發(fā)現(xiàn)在HCC細胞中過表達miR-30a-3p具有良好的抗腫瘤作用。作為重要的腫瘤促進因子，OCT-1能夠作為轉錄因子介導多種下游基因的轉錄，這些因子主要是細胞轉移與侵襲相關因子，也包括部分耐藥相關因子。這使得OCT-1是HCC治療的理想干預靶點：抑制OCT-1的活性或下調其表達水平既能夠直接抑制HCC的增殖、轉移與侵襲作用，同時也能夠促進HCC細胞對其他抗腫瘤藥物的敏感性。