放射性視神經病變相關microRNA篩選及其應用價值

張麗娜，吳伯樂，黃武，倪麗莎，胡夏云

放射性視神經病變（RION）是頭頸部腫瘤放射治療后的嚴重并發癥，可導致完全失明的一種放射性損傷[1-2]。已有研究報道，在視網膜尤其是視網膜神經節細胞中，microRNAs存在差異表達并具有組織特異性特點[3]，這些差異表現出明顯相關性。近期有研究報道放射損傷可導致組織細胞microRNAs表達譜發生改變[4]，如Templin等[5]對部分接受1.25 Gy X射線照射后的人群進行分析后發現，照射后外周血中有45種microRNAs表達水平明顯上調，并導致相應的靶基因表達水平降低，這表明外周血micro-RNAs差異表達可作為放射損傷的分子標志物。本研究對RION相關microRNA進行篩選，并探討其臨床診斷價值，現報道如下。

圖5 中重度IBD患者治療前腸黏膜組織VEGF-A表達（免疫組化染色，×200）

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至2021年6月浙江省麗水市人民醫院接受頭頸部放療并發生RION患者16例（RION組）和同期未發生RION的頭頸部放療患者16例（對照組），并選取視網膜神經節細胞株（RGC-5）（購自美國ATCC細胞庫）為研究對象。納入標準：（1）頭頸部腫瘤診斷明確；（2）擬行調強放療；（3）簽署知情同意書。排除標準：（1）普通放療者；（2）合并視神經病變者；（3）放療前接受過化療者。RION組男9例，女7例；平均年齡（48.2±14.2）歲；原發病為鼻咽癌7例，腦腫瘤8例，淋巴瘤1例。對照組男8例，女8例；平均年齡（46.6±16.6）歲；原發病為鼻咽癌9例，腦腫瘤7例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 放射損傷模型的構建 應用直線加速器對RGC-5細胞進行照射，吸收劑量分別為0、2、4和8 Gy，照射后于不同時間在顯微鏡下觀察細胞的形態變化，分析放射損傷后不同時間點RGC-5細胞的活性。

1.2.2 Real-time PCR檢測放射前后microRNA表達情況 根據RION相關差異表達microRNA分子序列，委托深圳吉瑪基因公司合成相關的microRNAmimics（模擬分子）和inhibitor（抑制分子），并采用lipo2000轉染試劑進行細胞內轉染，分別上調和下調RGC-5細胞內相關差異microRNA的過表達和低表達。轉染后檢測目標microRNA的表達及對RGC-5細胞放射損傷的影響。

1.2.3 標本留取 患者于接受放療前及放療后分別留取外周血，并提取總RNA后放置于－80℃冰箱中待檢。

1.3 統計方法 采用STATA8.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析；計數資料采用2檢驗；采用貝葉斯定理評價RION相關差異表達mciroRNA預測或早期診斷RION的臨床價值，并采用受試者工作特征曲線（ROC）進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RGC細胞系培養及放射模型 照射后4 Gy組和8 Gy組較其他兩組細胞生長和形態發生明顯改變（封三彩圖1）；MTT法檢測發現隨著照射時間的增加，2、4和8 Gy組細胞存活率較0 Gy組均下降（均P＜0.05），見封三彩圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同劑量X射線照射后細胞形態注：A為0 Gy組，B為2 Gy組，C為4 Gy組，D為8 Gy組

圖2 不同劑量組細胞存活率比較注：*＜0.05

2.2 microRNA差異表達情況 RGC-5細胞接受8 Gy照射7 d后，有9個microRNA表達水平變化不明顯，而miR-192和miR-34a表達明顯上調（F=8.56、11.23，均P＜0.05），見封三彩圖3。

圖3 micorRNA不同放射劑量表達水平比較注：A為不同劑量組的熱圖；B為不同劑量組microRNA表達水平變化曲線

2.3 RION組和對照組miR-192、miR-34a表達情況RION組和對照組放療前miR-192分別為0.53±0.22和0.50±0.23，miR-34a分別為0.60±0.31和0.67±0.38，兩組miR-192、miR-34a差異均無統計學意義（t=0.67、0.58，均P＞0.05），RION組放療后miR-192和miR-34a分別為1.13±0.42和1.16±0.41，均高于對照組的0.49±0.14和0.61±0.25（t=5.84、4.35，均P＜0.05）。

2.4 miR-192和miR-34a預測RION的價值分析以放療結束后血清miR-192為參考，預測RION的敏感性和特異性分別為93.75%和81.25%，ROC曲線下面積為0.97，截斷值為0.73；以放療結束后血清miR-34a為參考，預測RION的敏感性和特異性分別為87.75%和75.00%，ROC曲線下面積為0.88，截斷值為0.92。見封三彩圖4。

圖4 miR-192和miR-34a預測RION的ROC曲線

3 討論

臨床上通常將RION分為前部視神經損傷和后部視神經損傷兩種類型。前部視神經損傷為急性放射損傷，一般發生在急性放射暴露或眼眶腫瘤大劑量放療后，表現為視乳頭出血水腫，視網膜管閉塞呈白線狀，多為大劑量電離輻射直接損傷和神經所致出血水腫[6]。后部視神經損傷具有一定的潛伏期，早期眼底檢查正常，從視神經損傷到出現臨床癥狀為放療后數月甚至數年，因此又稱遲發性RION[7-8]。

隨著放療技術的提高及劑量分割等放療方法的改進，急性放射損傷已非常少見，通常所指RION一般多為遲發性RION。動物實驗及臨床研究證明，視神經和視交叉對放射線敏感性較高，放射線導致視神經損傷的機制包括：（1）電離效應；（2）導致微循環障礙；（3）氧化損傷；（4）細胞DNA損傷等[9]。這些損傷機制能夠解釋急性RION的損傷原理和病理特點，而遲發性RION的發病機制目前尚不完全清楚。如何明確遲發性RION不同階段的發生、發展規律和組織病理學特點，并在此基礎上揭示其發病機制，是實現RION早期診斷的前提，也是對RION進行有效治療的基礎[10]。RION多為雙眼先后發病，初期沒有任何癥狀，待患者視力出現明顯下降時則神經已發生萎縮。目前臨床上尚缺乏針對視神經萎縮的確切治療方法，因此放射性神經損傷預后極差，給患者帶來了極大的痛苦。目前多數學者已達成共識，只有對早期診斷的RION患者進行積極的高壓氧治療，才能挽救并保留部分視力。然而，目前尚沒有任何一種方法能夠對放射暴露后的人群進行RION實時監測，也沒有任何技術手段或標志物能對RION進行早期診斷。Lee等[11]甚至認為，對于已經發病的RION患者目前任何相關治療方案都未被證實有效。如何對RION進行實時監測和早期診斷，以便盡早采取預防和治療措施，已經成為制約RION防治的難題和瓶頸。

圖6 中重度IBD患者治療后腸黏膜組織VEGF-A表達（免疫組化染色，×200）

圖7 對照組腸黏膜組織VEGF-A表達（免疫組化染色，×200）

圖8 血清miR-19b、miR-9及miR-155-5P及聯合檢測診斷ESCC的ROC曲線

目前，將microRNAs作為RION分子標志物的相關研究在國內外鮮有報道。本研究結果顯示照射后4和8 Gy組較其他各組細胞生長和形態發生明顯改變，這提示視網膜神經節細胞對放射較為敏感，且存在劑量依賴性。隨著照射時間的增加，2、4和8 Gy組細胞存活率較0 Gy組有顯著差異（P＜0.05）。同時本研究證實miR-192和miR-34a表達在放射治療后明顯上調，這提示miR-192和miR-34a可能與RION的發生及發展有關。臨床研究進一步發現以放療結束后血清miR-192為參考，預測RION的敏感性和特異性均較高，因此，miR-192和miR-34a可作為預測其發生的血清學標志物。同時，進一步對miR-192和miR-34a參與RION的分子機制進行研究，有望開發出預防或治療RION的microRNA靶向藥物。

本研究也存在一定的局限性，首先納入RION患者的例數較少，導致統計學效能不高。其次，不同患者接受的放療劑量存在一定差異，這些差異可能是導致RION發生及microRNA表達變化的重要原因。因此，后續應加大樣本量，同時進行回歸分析，降低混雜因素對RION發生的影響，進一步明確microRNA在RION發生及發展中的作用及其作為預測生物學標志物的可行性。