2021 年天津市規模化奶牛場隱孢子蟲病調查

劉瑩/天津市動物疫病預防控制中心 300402

隱孢子蟲（Cryptosporidium sp）是Tyzzer 于上世紀初（1907 年）在實驗小鼠的胃腸道內首先發現的能引起人和多種動物腹瀉的寄生原蟲。隱孢子蟲病是隱孢子蟲感染引起的一種慢性、進行性、接觸性傳染病。隱孢子蟲病潛伏期長，一年四季均可發生，無有效阻斷措施和治療措施，一旦感染往往難以治愈，只有淘汰根除。該病主要感染初生犢牛、哺乳犢牛和斷奶犢牛，部分泌乳牛也可感染。該病在天津地區關注度較低，因此，規模牛場全面的檢測的報道不多。經調研初步了解，本地區犢牛腹瀉比較普遍，漸進性消耗較大，嚴重影響后期奶牛的產奶量。嚴重的導致犢牛死亡，危害嚴重。基于此，在天津市規模化牛場開展了該病流行率測量的橫斷面研究，為科學防控該病提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 目標群天津市內存欄量1000 頭以上的部分規模奶牛場。

1.2 抽樣策略

1.3 調查對象研究類型是基于問卷調查和電話回訪的橫斷面調查研究。選取天津市的4 個區，每區選一個牛場進行橫斷面抽樣調查。

1.4 抽樣策略與樣本量的計算樣本量計算公式為n=pq/(d/Zα)2，q=1-p，設允許誤差d=0.1p，Zα 為顯著性檢驗的統計量，當顯著性水平α=0.05 時，Zα=1.96。根據文獻設定我市奶牛場隱孢子蟲感染率P 為28%，應采樣本量約1000 份。

式中：n 為樣本量；z 為置信區間相關的標準誤差；p 為總體的估計差異性；q 為100-p；e 為相對誤差。

1.5 病例定義隱孢子蟲病陽性個體：經實驗室隱孢子蟲抗原ELISA 檢測結果為陽性的牛只。

1.6 檢測方法使用隱孢子蟲糞便抗原ELISA 方法進行檢測，該方法的敏感性(Se=95%)和特異性(Sp=96%)。出于經費考慮，實際檢測過程中制作一份檢測樣品，結果代表樣本結果，樣品檢測沒有重復。

2 實驗步驟

2.1 儀器設備微量可移動移液器及配套槍頭；恒溫培養箱；4℃冰箱；-20℃冰箱；計時器；記號筆；振蕩器；酶標儀（含波長450mm 的濾光片）；去離子水或蒸餾水；洗板機。

2.2 試劑及樣品制備洗滌工作液使用前，濃縮的洗滌液進行室溫平衡（20℃～25℃），并混勻，（若有沉淀，最好在37℃很穩培養箱中加熱5～10min，直至沉淀完全溶解），蒸餾水進行10 倍稀釋，混勻。稀釋液可4℃存放4 周。

企業應把培訓工作納入整體規劃中，企業領導者應在戰略上高度重視員工培訓，“把培訓工作當作一項長期的基礎工作來抓，并將培訓情況作為每個員工工作考核的重要內容”［3］。

樣品處理：在2mL EP 管中加入2g 糞便樣品，做好樣品標記。加入1mL 樣品稀釋液，對稀釋后的糞便樣品逐份進行震蕩混勻處理。靜置樣品，取上清液待檢測。

2.3 實驗步驟

（1）所有試劑在使用前進行室溫平衡，使用渦旋振蕩器對所有的試劑進行混勻；

（2）去除密封的抗原包背板，沿包裝袋缺口處死開；

（3）取出所需量的微孔板固定與板架上，其余板條放入密封袋內保存。）記錄樣品位置。按照要求加入陽性對照，100μL/孔，陰性對照，100μL/孔，稀釋好的樣品，100μL/孔。每孔加入，100μL/孔 1 號酶結合物。用移液槍緩慢混勻孔中液體；

（4）蓋上封板膜，室溫孵育30min；

（5）洗板：小心去掉封板摸。洗板機進行3 遍洗板；

（7）每孔加入100μL 底物溶液，封板摸封死，室溫避光孵育15min；

（8）終止液，50μL/孔，震蕩混勻，在酶標儀450nm 讀數，記錄樣品及陰性、陽性對照的吸光光度。

2.4 結果判定陰性對照OD＜0.2，陽性對照OD＞0.2 時試驗成立。

表1 隱孢子蟲糞便樣品ELISA 檢測結果判定標準

2.5 問卷調查設計針對養殖場/戶的結構性問卷，內容包括牛場的生產管理、地理信息、歷史疫情、傳播相關風險因素等。田間調查和問卷填寫由經培訓的獸醫人員統一進行。

3 數據處理和分析方法

應用Excel 進行數據匯總，應用Spss 進行數據統計。

4 結果

4.1 樣本量選取天津市試驗高水平較高的分布與不同區的四個規模牛場。四個場分別位于寶坻區、靜海區、寧河區、濱海新區。并于抽樣前2 周電話確定抽樣框共4 家。共采集1000 份樣品。由于經費有限，處理并檢測樣品1000 份。

4.2 個體流行率隱孢子蟲是一種重要的人畜共患寄生性原蟲。隱孢子蟲感染各階段奶牛，是引起犢牛腹瀉的重要誘因。小牛臨床感染的特征是淡黃色腹瀉伴脫水、厭食和酸中毒。食欲減退、消瘦，易繼發細菌感染而死亡。

檢測樣本1000 份，陽性樣本123 份，個體表觀流行率12.3%。根據個體診斷實驗的敏感性(Se=95%) 和特異性(Sp=96%)，計算個體真實流行率為9.1%(CL95%,7.3%～10.9%)。

圖1 真實流行率圖示

圖2 各場樣品隱孢子蟲檢測陽性率

表2 各場樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率

圖3 各場哺乳犢牛陽性率

表3 各場哺乳犢牛樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率

圖4 各場斷奶犢牛陽性率

表4 各場斷奶犢牛樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率

圖5 各場哺乳犢牛陽性率

表5 各場樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率

4.3 空間分布抽樣的4 個區的規模化場全部為陽性場點。因經費和抽樣點數不足，另有其他區縣未涉及。因此，本項目未涉及的區縣也無法排除陽性場點的存在。因此，本次初步調查無空間分布證據。

圖6 陽性場群的空間分布

被調查的四個規模化養殖場，經檢測全部為隱孢子蟲陽性場。其中，A 場的陽性率最高，D 場的陽性率最低。

4.4 群間分布檢測結果可見，哺乳犢牛的陽性率為22.33%，陽性率最高。其次為泌乳牛9.66%，斷奶犢牛4.63%，青年牛和干奶牛的檢測陽性率為0 。

圖7 不同階段牛陽性率

表6 不同牛群樣品檢測隱孢子蟲陽性率和真實流行率

5 分析與討論

本次規模化奶牛場隱孢子蟲病初步調查，采取分層隨機抽樣的方法，抽取四個區的4 個規模化奶牛場，共采集、處理、檢測樣品1000 份。被檢測場均有奶牛隱孢子蟲陽性樣本。可以推測隱孢子蟲在我市規模化奶牛場中已經具有一定的污染面。推測牛群隱孢子蟲感染比較普遍，場群流行率比較高。

根據個體表觀流行率12.3%，診斷實驗的敏感性(Se=95%)和特異性(Sp=96%)，規模化奶牛場的隱孢子蟲的陽性率為9.1%(CL95%,7.3%～10.9%)。其中，哺乳犢牛的檢測陽性率最高22.33%，真實流行率為20.1%(CL95%,16.3%～23.9%)。

根據初步調查結果可見，隱孢子蟲在規模化牛場的感染比較普遍，調查品種均為荷斯坦牛，各年齡段均可發病，其中以犢牛感染率相對較高，其次為斷乳牛。

結果提示A 場的哺乳犢牛陽性率遠高于其他三個規模場。根據問卷調查結果，發現A 場于采樣前2 個月引進一批待產奶牛，來源復雜。生產犢牛造成隱孢子蟲陽性率顯著高于其他規模場哺乳犢牛群體。因此，盲目引種混群是A 場犢牛腹瀉嚴重，且隱孢子蟲感染率高的主要原因。