獸用生物制品中支原體的污染來源及檢測預防控制策略

于昌貴 葛兆寧/天津市中升挑戰生物科技有限公司 300380

支原體屬于自然界中結構最簡單且體積最小的原核生物，濾菌器難以對其傳播進行有效阻攔，同時支原體自身針對多方面的抗生素均能夠體現出抗藥性，相關的細胞器中含有濃度較高的粘附蛋白，可通過對真核細胞進行粘附，直接向細胞內部穿入。獸用生物制品的原材料包括動物組織、動物血液、原蟲、微生物代謝產物以及微生物等多個方面，可針對動物傳染病或其他相關疾病進行預防、治療、診斷，屬于一類免疫制劑，其安全性能夠對動物健康以及人類健康起到直接或是間接的影響作用，所以針對獸用生物制品的生產質量予以充分重視，既有利于保障動物健康，也有利于維持人類社會的穩定和諧。當前支原體在自然界中已經被發現100 種左右，其均能夠在一定程度上導致動物或是人類出現生長發育停滯、呼吸道感染以及免疫系統損傷等多方面情況，所以當前支原體已經吸引了醫學界以及獸醫界的廣泛關注。由此可見，針對獸用生物制品中支原體的污染來源及檢測預防控制策略進行分析具有重要意義。

1 獸用生物制品中支原體的污染來源

1.1 血清及胰酶血清屬于疫苗生產過程中的主要原材料之一，被支原體污染的可能性較大，而且難以通過除菌過濾膜將其有效去除。胰酶則屬于疫苗生產過程中進行細胞傳代以及消化時必須應用的重要物料，主要來自于牛、豬、羊等牲畜的胰腺，易出現支原體污染情況。

1.2 細胞及種毒在疫苗生產過程中，種毒能夠起到十分重要的影響作用，甚至能夠決定疫苗的屬性特點以及內在質量，如果種毒受到支原體污染，則能夠出現逐級培養放大的情況，也就必然導致疫苗質量受到影響。并且，對細胞進行培養時，支原體污染同樣能夠產生較大的影響，一般來說，導致細胞出現污染情況的支原體主要來自牛、豬和人類，同時也包括梨支原體、豬鼻支原體、發酵支原體、口腔支原體、唾液支原體、精氨酸支原體等多種支原體，且其中部分來自于相關工作人員。

1.3 原代細胞及動物組織對豬瘟活疫苗進行生產的過程中，主要需要應用羊睪丸或是牛睪丸的原代細胞作為其中所需的原材料，但是牛、羊其自身即為易感支原體的動物，同時毛發較多，若出現消毒不全面、不徹底的情況，發生支原體污染現象的可能性將更大，所以應用動物組織作為獸用生物制品的原材料，極有可能出現支原體感染的情況，也就能夠對接種動物造成嚴重威脅。

1.4 環境污染支原體能夠在超凈臺內進行細胞傳代，并且傳播速度相對較快。與此同時，活支原體能夠在其中存活至少4～6d，還能夠成功實現復壯，且受到支原體污染的細胞傳播結束之后，還能向干凈細胞進行傳遞，且直至6 周以后，仍能夠在其中檢測出陽性，可見支原體不僅傳播速度較快，且傳播難度較低。

2 支原體檢測方法

2.1 PCR 法PCR 法具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短、重復性良好、產率高、易自動化等多方面優勢，但與此同時，其中假陰性、假陽性出現的可能性也相對更大，對相關工作人員提出了更多更高的要求。其主要可以針對巴氏桿菌、沙門氏桿菌、豬鏈球菌、大腸桿菌、豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒、二型豬瘟病毒、新城疫病毒等多項病原的擴散情況進行有效檢測，可見該方法在獸用生物制品的生產質量控制工作中能夠體現出較高的應用價值，同時，其在相關的疫苗質量檢驗工作中應用效果也較為良好。

2.2 一步法試劑盒檢測法一步法試劑盒中所應用的原理在于環介導等溫擴增技術，其具有操作簡單的優勢，僅需1μL 的加樣量，即能夠借助變色情況對檢測結果進行判定。從整體上來看，該檢測方法周期較短，檢測結果可用肉眼直接觀察，并且具有較高的檢測準確率。

2.3 ELISA 法根據“ELISA 抗體夾心法”原理，某公司研制并推廣了支原體檢測試劑盒。該試劑盒可以有效避免出現假陰性和假陽性的情況，不僅操作過程便捷，且省時省力，同時結果準確性較高，并能夠體現出高通量、高靈敏度和價格低廉的優勢。首先在樣品上標注地高新標簽和生物素標簽，再針對孔板使用預先包被對鏈親和素進行獲取，之后加入抗地高新檢測抗體，且需注意，在將該抗體加入之前，需首先進行堿性磷酸酶標記，最后將底物顯色加入其中，采用比色法獲取檢驗結果，以判定其中是否存在支原體。

2.4 分離培養法在固體培養基或是液體培養基之中，均可應用分離培養法開展分離培養工作，在固體培養基之中，多數支原體能夠呈現出典型的菌落，在液體培養基之中，支原體則能夠呈現出pH 值得顯著變化，由此可見，分離培養法的應用效果良好，但同時該方法敏感性不足、培養時間相對較長，同時受到抗生素自身影響的可能性較大，且不能將其中存在的全部支原體有效檢出。當前《中國獸藥典》相關內容仍指定分離培養法作為開展支原體檢測工作的基本方法，但是在實際上，我國獸用生物制品企業的生產和發展，均需有更加先進、更加有效的快速檢驗方法支持工作，所以針對分離培養法，需要進行進一步的優化完善，或是與其他方法進行聯合應用，以促使其中的支原體檢出率得到有效提升。

3 預防支原體污染方法

3.1 環境控制針對生產車間，應保持其中的衛生環境良好，定期開展清潔工作和消毒工作，并需要定期檢測其中的衛生情況，以保障其中各項參數均處于標準范圍內，且持續可控。在進行生產的過程中，需要針對流程之中的各項工作環節進行持續細化，嚴格控制工作人員、物品、以及污物出入的路徑，以盡可能降低交叉感染情況出現的機率。生產工作結束后，應徹底消毒生產設備，并根據各項設備及器械的實際特點，采用消毒水浸泡的方式或是高壓滅菌的方式對其進行消毒處理，且車間內清潔區的全部物品，均應使用紫外線照射或是表面消毒的方式進行處理。

3.2 原材料控制血清、胰酶、細胞一類的動物源性原材料在獸用生物制品之中，均屬于占據重要地位的生產材料，同時也是支原體生存的重要基礎。根據相關研究顯示，當前血清或細胞的原材料，能夠導致至少20 種支原體發生污染，所以不僅需要保障無菌狀態，還應該在開展應用之前，強化相關的支原體檢驗工作，以盡可能避免出現支原體污染擴散的情況。與此同時，在開展細胞培養工作的過程中，相關人員還應注意保持個人衛生習慣良好，同時完全遵循操作規范，以降低支原體污染情況出現的幾率，之后還應以相關制度為基礎，對檢驗體系進行持續完善，嚴格檢驗種細胞、原代細胞以及帶代次細胞，以保障細胞中不會出現支原體污染的情況。另外，針對新引進的細胞或是種毒，應該首先進行隔離培養工作，確認檢驗結果合格，方可應用于車間生產工作。

3.3 消毒滅菌采用正確的消毒滅菌處理方法，有利于控制各種微生物以及污染物滋生，所以，一方面，需要針對生產生物制品過程中需要應用的全部物品以及器具，開展全面徹底的消毒滅菌工作，確認無菌測試結果合格，方可再次投入到使用當中，以能夠從源頭處開始對污染物的產生起到有效的控制作用，另一方面，應該注意，其中應用的消毒滅菌方法正確與否，例如干熱烤箱或是高壓鍋中大量堆積物品，則可能導致出現加熱不均的情況，也就能夠引起滅菌不徹底的情況，或是在進行滅菌工作時，存在循環時間過短的現象，特別是其中液體劑量已經超過500mL，或是其中含有淀粉、瓊脂一類的膠質物質，能夠導致滅菌效果大幅度降低，所以在開展消毒滅菌工作的過程中，還需要對滅菌材料的性質、質量、尺寸、體積等各個方面進行充分考慮和合理協調，以保障消毒滅菌工作效果良好。

3.4 合理應用抗生素將抗生素應用于支原體污染之中，可以起到較好的抑制作用，所以在開展生物制品生產工作的過程中，需要對抗生素進行合理應用，以降低支原體污染情況出現的機率。但是從實際上來看，支原體對于一般抗生素普遍不具有良好的敏感性，甚至存在抗藥性，所以需要提升抗生素選擇的合理性，在保持用藥劑量科學合理的同時，盡可能不對細胞正常功能產生影響，并在此同時對支原體污染情況進行有效控制。

4 結語

支原體屬于一類病原微生物，針對人體或動物均能夠產生致病性，一旦生物制品受到支原體污染，其品質將能夠出現大幅度的下降，而支原體污染這一情況能夠體現出隱蔽性特征，所以還需針對相關的原材料以及環境加強檢驗和控制工作，以保障獸用生物制品的質量。當前獸用生物制品的生產廠家所應用的篩查方式雖然快捷有效，但是相對于與相關標準來說，仍然不夠完善，所以有必要根據實際情況對管理制度進行進一步的規范，并嚴格控制各個操作環節，以能夠將潛在的污染風險完全排除。