Midkine對神經母細胞瘤TNB1細胞生長與分化的影響*

朱琳 陳潞萍 牟萍

神經母細胞瘤是一種發生在外周交感神經系統的小兒惡性腫瘤，90%的神經母細胞瘤患者發病于10歲之前，且惡性度高，約占兒童腫瘤致死率的15%[1]。早期的研究發現，中期因子（midkine，MK）在神經母細胞瘤患者腫瘤組織中高表達[2]，而且在神經母細胞瘤患者血清中MK的含量顯著高于正常組[3]。MK是一種肝素結合生長因子，在胚胎期高表達，成年后其表達量處于較低水平[4]。在腫瘤研究方面發現MK表達與多種癌癥發生相關，在非小細胞肺癌[5]、黑色素瘤[6]、腸癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]、食管鱗狀細胞癌[10]、間皮瘤[11]以及神經母細胞瘤[3]等多種腫瘤患者血清中發現MK的含量顯著增加。同時，研究發現在非小細胞肺癌中MK通過調節Notch-NF-κB通路，增強細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進腫瘤發展[12]。在其他腫瘤中，MK的表達與腫瘤細胞的生長和轉移也有密切的關系，如在神經膠質瘤中，MK通過誘導生成生長因子CCL5，進而促進神經膠質瘤細胞的生長[13]；在前列腺癌干細胞中，敲減MK可以引起細胞在S期以及G2/M期發生細胞周期阻滯[14]；在黑色素瘤中，MK通過mTOR通路促進腫瘤轉移[15]。目前，雖然MK在多種腫瘤中的生物學作用被發現，然而關于其在神經母細胞瘤發生發展中的作用及其機制未被完全闡明。

本研究通過分析神經母細胞瘤臨床患者數據庫信息，對相關的細胞及動物實驗進行驗證，以期明確MK對神經母細胞瘤TNB1細胞生長及分化能力的影響以及作用機制，旨在揭示MK在神經母細胞瘤發生發展中的意義，為神經母細胞瘤的臨床治療提供新的治療靶點和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640培養液、DMEM培養液、MK shRNAs（MK shRNA-1編碼序列：5’-CCGGCGACTGCAAGTACAAGTTTGA CTCGAGTCAAACTTGTACTTGCAGTCGTTTTTG-3’；MK shRNA-2 編碼序列：5’-CCGGCAAGACCAAAGC AAAGGCCAACTCGAGTTGGCCTTTGCTTTGGTCT TGTTTTTG-3’）、腎細胞癌下調蛋白1（downregulated in renal carcinoma 1，DRR1）shRNAs（DRR1 shRNA-1編碼序列：5’-CCGGCAAGAAGAAGAAGGAGGAG CTCTCGAGAGCTCCTCCTTCTTCTTCTTGTTTTTT G-3’；DRR1 shRNA-2 編碼序列：5’-CGGCCTAGTCT TATGGAAAGCAAACTCGAGTTTGCTTTCCATAAG ACTAGGTTTTTTG-3’）以 及control shRNA（美國Sigma公司），病毒包裝載體psPAX2和pMD2.G（美國Addgene公司），脂質體Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），ISOGEN裂解液、逆轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），基質膠（美國BD Biosciences公司）。7 500型熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床數據來源及分析 使用R2（http://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi）臨床患者數據庫中的Kocak-649-custom-ag44kcwolf數據庫（n=476）及Jagannathan-100-custom ilmnhwg6v2數據庫（n=100）進行分析。在統計神經母細胞瘤患者生存率時，利用Kocak-649-custom-ag44kcwolf數據庫中476例患者的相關數據，通過使用卡普蘭掃描的分析方法，可直接將所有樣品分成MK或者DRR1的高表達組或低表達組，并使用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線。

1.2.2 細胞培養以及慢病毒感染 人神經母細胞瘤TNB1細胞培養于含有10% FBS的RPMI-1 640培養液中。293T細胞培養于含有10% FBS的DMEM培養液中。上述細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養，根據各細胞的生長情況采用0.25%胰蛋白酶消化進行傳代。

293T細胞中包裝所得慢病毒進行滴度測定，按照感染復數（multiplicity of infection，MOL）為5，按比例將慢病毒與Polybrene穿孔素（濃度1 μg/mL）共同加入TNB1細胞進行細胞感染實驗，24 h后換液并加入嘌呤霉素（濃度1 μg/mL）進行感染細胞的篩選。

1.2.3 RNA提取、逆轉錄和Real-time PCR 先用磷酸鹽緩沖液清洗細胞3次，然后使用ISOGEN裂解液按照說明書操作步驟從細胞中提取總RNA并測定RNA濃度。取1 μg RNA通過逆轉錄反應獲得cDNA。各取2 μL cDNA樣品，利用SYBR Green試劑盒以GAPDH作為內參進行Real-time PCR反應。PCR反應條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s；56℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。引物序列：人MK上游引物為5’-C GCGGTCGCCAAAAAGAAAG-3’，下游引物為5’-T ACTTGCAGTCGGCTCCAAAC-3’；人DRR1上游引物為5’-GAATACAGAGAGTGGAATCCGGAGCTCA TC-3’，下游引物為5’-GCTTGGCTTCCAGCTCCTCCT TCTTCTTCT-3’；人酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）上游引物為5’-GAGGAAATTGAGAAGCT GTCC-3’，下游引物為5’-CAGACACGAAGTAGACT GAC-3’；人生長相關蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）上游引物為5’-AGTGAGCAAGCG AGCAGAA-3’，下游引物為5’-GTTGCGGCCTTATG AGCTT-3’；人GAPDH上游引物為5’-ATCATCCCT GCCTCTACTGG-3’，下游引物為5’-CCCTCCGACGCC TGCTTCAC-3’。

1.2.4 軟瓊脂克隆形成實驗 將1.5 mL的下層瓊脂（0.5%瓊脂/RPMI-1640+10% FBS）鋪入6孔板的底部，待凝固后鋪入1 mL含有2 000個TNB1細胞的上層瓊脂（0.33%瓊脂/RPMI-1640+10% FBS），上層瓊脂凝固后將6孔盤置于37℃、5%CO2培養箱中培養。24 h后在上層瓊脂上方加入1 mL無血清RPMI-1640培養基。2周后，使用結晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照并進行計數。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析。所有數據結果使用±s 表示，臨床數據采用對數秩檢驗分析，其余組間差異使用t檢驗分析。以P＜0.05為差異具有統計學差異。

2 結果

2.1 MK表達量與神經母細胞瘤患者生存率的關系

通過分析神經母細胞瘤臨床數據發現（Kocak-649-custom-ag44kcwolf數據庫，n=476），MK表達量與神經母細胞瘤患者生存率呈負相關。MK高表達患者（n=325）的生存率顯著低于MK低表達患者（n=151）的生存率（P＜0.01，圖1A）。

圖1 MK調節TNB1細胞的生長與分化

2.2 MK調節TNB1細胞的生長與分化

為了進一步分析MK在神經母細胞瘤中的作用，本實驗分為對照組（Con. shRNA）和MK shRNA組（MK shRNA-1、MK shRNA-2）。實驗利用含有Con.shRNA和MK shRNA的慢病毒分別感染TNB1細胞并在低血清（2% FBS）狀態下培養2 d。在顯微鏡下進行拍照后，使用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞進行細胞計數。結果顯示，MK shRNA組的TNB1細胞數量較對照組明顯減少（P＜0.01，圖1B），同時MK shRNA組的TNB1細胞突起變長，呈現分化趨勢（圖1C）。為了確認細胞的分化狀態，進一步利用Real-time PCR分析了神經母細胞瘤細胞分化標志物TH以及GAP43的表達水平，結果顯示MK shRNA組的TNB1細胞中TH（P＜0.01，圖1E）以及GAP43（P＜0.01，圖1F）的表達量顯著高于對照組。

2.3 MK調節DRR1在TNB1細胞中的表達

為了研究MK在神經母細胞瘤中的作用機制，進一步從神經母細胞瘤臨床患者數據庫（Kocak-649-custom-ag44kcwolf數據庫）中篩選了與MK表達相關的基因，發現DRR1的表達量與MK呈負相關（P＜0.01，圖2A）。該結果在另一個神經母細胞瘤臨床患者數據庫（Jagannathan-100-custom ilmnhwg6v2數據庫）中也得到了驗證（P＜0.01，圖2B）。同時，利用MK shRNA慢病毒感染TNB1細胞，采用Real-time PCR對DRR1的表達水平進行測定。結果顯示，與對照組相比，MK shRNA組細胞的DRR1表達量顯著增高（P＜0.01，圖2C）。神經母細胞瘤臨床患者數據庫（Kocak-649-custom-ag44kcwolf數據庫，n=476）的分析結果顯示，DRR1表達量與神經母細胞瘤患者生存率呈正相關，DRR1高表達組患者（n=362）的生存率顯著高于DRR1低表達組患者（n=114）的生存率（P＜0.01，圖2D）。隨后，利用攜帶DRR1 shRNA的慢病毒感染TNB1細胞，并分析細胞生長以及分化情況。本實驗分為對照組（Con. shRNA）和DRR1 shRNA組（DRR1 shRNA-1、DRR1 shRNA-2）。結 果顯示，DRR1 shRNA組的TNB1細胞數量較對照組增加，同時細胞突起較對照組縮短（圖2E）。

圖2 MK調節TNB1細胞中DRR1的表達

2.4 下調DRR1表達對于MK敲減后TNB1細胞分化和軟瓊脂克隆形成的影響

為了驗證MK是否通過調節DRR1表達，從而參與調節TNB1細胞生長以及分化，本實驗利用攜帶MK shRNA與DRR1 shRNA的2種慢病毒感染的TNB1細胞，2 d后分析細胞的生長與分化情況。本實驗分為對照組（Con. shRNA）、MK shRNA-1組和MK shRNA-1+DRR1 shRNA-1組。結果顯示，MK shRNA-1+DRR1 shRNA-1組的細胞突起較MK shRNA-1組變短（圖3A），并且分化標志物TH（P＜0.01，圖3B）以及GAP43（P＜0.01，圖3C）的表達量顯著低于MK shRNA-1組。軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示，MK shRNA-1+DRR1 shRNA-1組的細胞克隆數量顯著高于MK shRNA-1處理組（P＜0.01，圖4）。

圖3 下調DRR1表達對于MK shRNA對TNB1細胞分化的影響（n=3）

圖4 下調DRR1表達對于干擾MK shRNA對TNB1細胞克隆形成的影響（n=3）

3 討論

近年來，MK表達在多種腫瘤中被發現，其作用及相關分子機制逐漸被證實，然而在神經母細胞瘤中的作用尚未闡明。在影響腫瘤細胞分化方面，有研究報道MK的表達與食管鱗狀細胞癌的分化不良緊密相關[16]，但關于MK在神經母細胞瘤分化中的作用鮮見報道。本研究發現，MK表達水平的改變能夠影響神經母細胞瘤TNB1細胞的分化。通過深入分析神經母細胞瘤臨床患者數據庫信息發現，在神經母細胞瘤中，MK與DRR1表達呈負相關，進一步的實驗研究表明，MK可以通過調節DRR1的表達進而調控TNB1細胞的生長與分化，該研究結果為神經母細胞瘤發生發展的分子機制提供了新的理論基礎。

DRR1因其在腎細胞癌[17]、非小細胞肺癌[18]、肝癌[19]、纖維肉瘤[20]、星形細胞瘤[21]以及神經母細胞瘤[22]等多種腫瘤中表達量降低，被定義為腫瘤抑制因子。本課題組前期研究發現，在神經母細胞瘤細胞中過表達DRR1可下調Cyclin D1表達，導致細胞在G1/S期發生細胞周期阻滯，進而抑制神經母細胞瘤的增殖[22]。有研究發現，上調MK的表達可增加Cyclin D1表達[23-24]，并促進細胞周期由G1期向S期進行轉換[25]。有研究證實，Cyclin D1與細胞分化相關，下調Cyclin D1表達可以促進急性早幼粒細胞性白血病細胞分化[26-27]，且一些研究結果證明Cyclin D1的表達與細胞生長呈正相關[28-30]。本研究發現，下調MK表達可以抑制神經母細胞瘤的細胞生長，促進細胞分化，而DRR1的表達下調可以挽救由MK敲減引起的生長抑制以及促分化作用。以上結果提示，MK可能通過調節DRR1的表達，進而影響Cyclin D1的表達以及細胞G1/S期轉換，最終影響神經母細胞瘤的生長與分化。在后續研究中，本研究組將深入研究MK調節DRR1表達的分子機制，進一步揭示MK-DRR1-Cyclin D1軸在神經母細胞瘤中的作用。

綜上所述，在神經母細胞瘤中MK的表達量與患者生存率呈負相關，而其下游因子DRR1的表達量與患者生存率呈正相關。MK對DRR1呈負向調控作用，敲減MK將促進DRR1的表達，進而抑制TNB1細胞生長以及促進細胞分化。本研究結果揭示了MK調控神經母細胞瘤生長以及分化的相關分子機制，為臨床神經母細胞瘤的治療提供新的治療靶點和理論支持。