基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究清震湯治療偏頭痛的作用機(jī)制

徐小港，徐義峰，王 鈺，董 辛，章德林*，鄭 琴,3*

1江西中醫(yī)藥大學(xué)；2江西中醫(yī)藥大學(xué) 科技學(xué)院；3江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330004

偏頭痛(migraine)是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)的反復(fù)搏動(dòng)性頭痛，發(fā)作時(shí)常伴有面色蒼白、惡心嘔吐等自主神經(jīng)癥狀,持續(xù)時(shí)間一般是4～72 h[1]，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)流行病學(xué)顯示，偏頭痛全球患病率為11.6%，是人類致殘的主要慢性疾病之一[2]。目前，偏頭痛的西醫(yī)治療主要采用急性止痛和預(yù)防復(fù)發(fā)等方法，降低頭痛發(fā)作的頻率與程度，從而改善患者生活質(zhì)量[3],雖有一定療效，但易出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)或依賴性，且作用靶點(diǎn)單一，導(dǎo)致依從性較差，疾病難以根除。中醫(yī)藥在治療上具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑等作用特點(diǎn)，安全性高，在改善偏頭痛癥狀、減少?gòu)?fù)發(fā)次數(shù)等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

清震湯出自《素問病機(jī)氣宜保命集》，為劉完素而立，又名“升麻湯”，主治雷頭風(fēng)。方用升麻甘辛微寒，具升陽(yáng)祛風(fēng)止痛之功；蒼術(shù)辛溫味苦，可祛風(fēng)燥濕健脾；荷葉苦平，清熱祛風(fēng)，升發(fā)清陽(yáng)，三藥配伍，共奏升陽(yáng)化濕、清利頭目之效。該方雖僅以3味藥組成，但配伍精良，療效確切，被廣泛運(yùn)用于臨床，Guo等[4]運(yùn)用清震湯加味治療偏頭痛患者，總有效率達(dá)96.4%，Jiang[5]亦采用清震湯加味治療偏頭痛患者，結(jié)果顯示可明顯改善偏頭痛患者的臨床癥狀。清震湯治療偏頭痛效果肯定，但仍集中于臨床研究，其具體作用機(jī)制尚未闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)軟件等相融合的新興學(xué)科，其通過網(wǎng)絡(luò)可視化、組學(xué)等方法展示疾病、藥物、基因及靶點(diǎn)之間的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，尤其適合揭示中藥及復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的機(jī)理[6]。基于以上理論，本文以清震湯入血活性成分為研究對(duì)象，通過生物信息學(xué)分析，并將獲得的核心活性成分與潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，探究其治療偏頭痛的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，進(jìn)而闡釋其臨床應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵，為研發(fā)新藥及實(shí)驗(yàn)研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)，本研究思路流程圖見圖1。

圖1 研究流程圖Fig.1 Flow chart of research

1 材料與方法

1.1 清震湯藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

清震湯由蒼術(shù)、升麻、荷葉等3味中藥組成，本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)依次查詢上述3味中藥的有效成分，設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%與類藥性(drug-like，DL)≥0.18的2個(gè)ADME屬性值為篩選條件，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，獲取有效入血成分及其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)對(duì)清震湯入血活性成分靶基因的名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 偏頭痛相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及共同靶點(diǎn)的Venny分析

以“migraine”為關(guān)鍵詞，在DrugBank(https://www.drugbank.ca)以及GeneCards(https://www.Genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行檢索，得到偏頭痛的相關(guān)靶點(diǎn)。利用jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.Html)將清震湯的潛在靶點(diǎn)映射到偏頭痛的相關(guān)靶點(diǎn)，獲得清震湯治療偏頭痛的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 清震湯成分-偏頭痛靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.2”項(xiàng)所得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)為“medium confidence”(>0.4)，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及保存TSV格式的PPI數(shù)據(jù)，將PPI數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行圖像優(yōu)化，并運(yùn)用其中Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

1.4 富集分析

將“1.2”項(xiàng)所得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，Select Identifier設(shè)置為“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Select species”設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)定P<0.05，實(shí)現(xiàn)GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 “中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.2”項(xiàng)所得的潛在作用靶點(diǎn)及其相應(yīng)活性化合物，并結(jié)合“1.4”項(xiàng)KEGG通路富集分析結(jié)果，通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建清震湯“中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用其中Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

為驗(yàn)證篩選出的清震湯治療偏頭痛潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，將“1.5”項(xiàng)中核心活性成分與“1.3”項(xiàng)中IL6、CXCL8、FOS、TNF、VEGFA、PTGS2、EGF、IL1B等8個(gè)度值較高靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載活性成分的3D分子結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，以人源、分辨度及相關(guān)報(bào)道為參考，最終確定信息見表1，活性成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)均導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行脫水，并保存為pdb格式，再通過Autodock軟件進(jìn)行預(yù)處理及分子對(duì)接，運(yùn)用Pymol、Discovery Studio 2016軟件進(jìn)行輸出優(yōu)化。

表1 分子對(duì)接靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)信息Table 1 Molecular docking target protein structure information

2 結(jié)果

2.1 清震湯的活性成分及其靶點(diǎn)

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中得到蒼術(shù)、升麻、荷葉的活性成分共329個(gè)，經(jīng)OB≥30%與DL≥0.18的篩選及文獻(xiàn)檢索，共確定清震湯的活性成分40個(gè)，蒼術(shù)9個(gè)，升麻17個(gè)，荷葉15個(gè)，升麻與荷葉共同成分1個(gè)(見表2)。同時(shí)收集活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)，其中蒼術(shù)63個(gè)，升麻68個(gè)，荷葉333個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，清震湯活性成分可能作用的靶點(diǎn)為190個(gè)。

表2 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中保留的藥物活性成分信息表Table 2 Information table of active ingredients of medicines retained in TCMSP database

2.2 清震湯治療偏頭痛的潛在作用靶點(diǎn)

通過DrugBank、Gencards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行偏頭痛疾病靶點(diǎn)篩選，去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到相關(guān)靶點(diǎn)857個(gè)；運(yùn)用Venny作圖平臺(tái)獲得清震湯活性成分作用靶點(diǎn)映射于偏頭痛的相關(guān)靶點(diǎn)(潛在作用靶點(diǎn))87個(gè)(見圖2)。

圖2 清震湯治療偏頭痛潛在作用靶點(diǎn)Fig.2 The potential targets of Qingzhen Decoction in the treatment of migraine

2.3 清震湯治療偏頭痛潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將清震湯治療偏頭痛的潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)信息，為了更直觀了解作用機(jī)制，將PPI信息文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共含有86個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 074條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)12.5(見圖3)。再利用內(nèi)置Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，發(fā)現(xiàn)IL6、CXCL8、FOS、TNF、VEGFA、PTGS2、EGF、IL1B等節(jié)點(diǎn)度值較高，提示這些靶基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中較重要，其可能是清震湯發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 清震湯與偏頭痛共同基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Common gene protein interaction network between Qingzhen Decoction and migraine

2.4 富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)清震湯治療偏頭痛的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，均保留P<0.05的結(jié)果，得到GO條目436條，包括藥物應(yīng)答(response to drug)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)等生物過程(BP)條目336條，細(xì)胞外空間(extracellular space)、質(zhì)膜的組成部分(integral component of plasma membrane)等細(xì)胞組成(CC)條目28條,藥物結(jié)合(drug binding)，酶結(jié)合(enzyme binding)等分子功能(MF)條目72條，對(duì)較重要條目運(yùn)用Origin 2018繪制柱狀圖進(jìn)行可視化(見圖4)。

圖4 清震湯GO功能富集分析Fig.4 Analysis of GO function enrichment of Qingzhen Decoction

KEGG通路富集分析顯示，偏頭痛可能與TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、神經(jīng)信號(hào)傳遞通路(neuroactive ligand-receptor interaction)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-κB signaling pathway)等92條通路有關(guān)，取P值排名前20的通路，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路”，圖形節(jié)點(diǎn)為活性成分，正方形為靶點(diǎn)，倒三角形為通路；節(jié)點(diǎn)的面積及顏色透明度代表度值，面積越大、顏色越深說明該節(jié)點(diǎn)越重要(見圖5)。

圖5 清震湯“中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 "Traditional Chinese Medicine-Compound-Target-Pathway" network diagram of Qingzhen Decoction注：CZ表示蒼術(shù)；SM表示升麻；HY表示荷葉；SM&HY表示升麻和荷葉的共同成分。Note:CZ means atractylodes;SM means cohosh;HY means lotus leaf;SM&HY means the common component of cohosh and lotus leaf.

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

為明確靶點(diǎn)蛋白與所對(duì)應(yīng)的成分之間的結(jié)合活性，本研究選取核心活性成分為作為配體(見表3)，以IL6、CXCL8、FOS、TNF、VEGFA、PTGS2、EGF、IL1B等8個(gè)度值較高的基因作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。一般認(rèn)為，配體具有的潛在作用活性越強(qiáng)，與受體結(jié)合能量越低，對(duì)接打分則越高。分子對(duì)接所得結(jié)果顯示docking score均大于5，且形成范德華力、Pi-Alkyl作用、氫鍵等，提示核心活性成分與靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性，分子對(duì)接結(jié)果見圖6，部分分子對(duì)接圖見圖7。

表3 清震湯治療偏頭痛核心成分信息表Table 3 Information table of core components of Qingzhen Decoction for migraine

圖6 清震湯中核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接打分熱圖Fig.6 The molecular docking scoring heat map of the core active ingredients and key targets in Qingzhen Decoction

圖7 清震湯中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的部分分子對(duì)接圖(上：3D；下：2D)Fig.7 Part of the molecular docking diagram of the active ingredients in Qingzhen Decoction with key targets (top:3D,bottom:2D)注：a.TNF-豆甾醇；b.PTGS2-豆甾醇；c.FOS-豆甾醇。Note:a.TNF-stigmasterol;b.PTGS2-stigmasterol;c.FOS-stigmasterol.

3 討論與結(jié)論

偏頭痛是臨床最常見的原發(fā)性頭痛類型，其發(fā)生主要與感受閾值紊亂、疼痛調(diào)節(jié)功能障礙、皮質(zhì)興奮性異常及中樞敏化[7]等因素相關(guān)，且近年來呈現(xiàn)高頻化、慢性化的發(fā)展趨勢(shì)[8]。目前對(duì)于本病的病理機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍接受三叉神經(jīng)血管學(xué)說及遺傳學(xué)說。研究表明，三叉神經(jīng)通路中的中樞敏化與三叉神經(jīng)尾核(TNC)區(qū)域中小膠質(zhì)細(xì)胞所釋放的炎性介質(zhì)密切相關(guān)，且神經(jīng)源性炎癥被認(rèn)為是偏頭痛發(fā)生的基本病理特征[9,10]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生與外感風(fēng)寒濕邪、氣郁、痰濁及血瘀阻滯腦絡(luò)致不通則痛，或髓海不足、氣血虧虛等腦絡(luò)失養(yǎng)致不榮則痛有關(guān)，屬于“頭痛”“腦風(fēng)”等范疇。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，以此初步闡釋清震湯治療偏頭痛的潛在作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，槲皮素、山奈酚、豆甾醇等40個(gè)成分為治療偏頭痛的潛在活性成分。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)及“中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)IL6、CXCL8、TNF、PTGS2等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。IL6作為炎性因子，在眾多炎癥免疫反應(yīng)中起著重要作用[11]。研究表明，偏頭痛患者血清中IL6的水平升高可能與炎癥有關(guān)[12]。CXCL8在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有促炎作用，可介導(dǎo)白細(xì)胞向炎癥部位的遷移[13]。Sarchielli等[14]研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛發(fā)作期間CXCL8水平升高，亦有實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了該趨化因子參與偏頭痛發(fā)作期間的白細(xì)胞募集[15]。TNF在偏頭痛發(fā)病中的重要性已得到許多學(xué)者的認(rèn)同，TNF-α是神經(jīng)血管炎性疾病的潛在疼痛介質(zhì)，可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)致敏波谷減少抑制電流，增加興奮性和誘導(dǎo)COX-2的產(chǎn)生，從而促進(jìn)炎癥性痛覺過敏的發(fā)展[16,17]。Franceschin等[18]還發(fā)現(xiàn)偏頭痛誘導(dǎo)后，在動(dòng)物模型中TNF-α的mRNA表達(dá)增加。PTGS2基因是前列腺素的生物合成的核心酶，有研究表明前列腺素是偏頭痛的致痛因子之一[19]。

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)清震湯調(diào)治偏頭痛主要涉及TNF信號(hào)通路、神經(jīng)信號(hào)傳遞通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。實(shí)驗(yàn)表明[20]，TNF信號(hào)通路能夠促進(jìn)CGRP轉(zhuǎn)錄機(jī)制從而作用于神經(jīng)元受體，產(chǎn)生腦膜血管的無菌性神經(jīng)源性炎癥，最終導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)生。NF-κB信號(hào)通路涉及NO等多種炎性因子的合成與釋放。同時(shí)，神經(jīng)信號(hào)傳遞通路是質(zhì)膜上與細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)通路相關(guān)的受體配體的集合，與神經(jīng)功能密切相關(guān)[21]，該通路涉及神經(jīng)突觸上遞質(zhì)的合成、釋放及其與受體的作用，使疼痛信號(hào)傳遞至中樞神經(jīng)[22]。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HIF-1信號(hào)通路在體內(nèi)腫瘤進(jìn)展和血管生成中起著核心作用，可能與腫瘤所引起的偏頭痛有聯(lián)系[23]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上述信號(hào)通路通過參與炎癥、腫瘤、中樞神經(jīng)等一系列環(huán)節(jié)改善偏頭痛癥狀。分子對(duì)接結(jié)果表明槲皮素、山奈酚、豆甾醇等活性成分與靶蛋白IL6、CXCL8、TNF、PTGS2具有良好的對(duì)接活性，提示清震湯活性成分與靶蛋白穩(wěn)定結(jié)合，以此發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

本文以清震湯為研究對(duì)象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步揭示了清震湯可以通過多個(gè)活性成分及作用靶點(diǎn)、調(diào)節(jié)多條生物通路共同作用于偏頭痛，其中可影響藥物應(yīng)答、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)等生物過程。TNF信號(hào)通路、神經(jīng)信號(hào)傳遞通路、HIF-1信號(hào)通路等可能是其治療偏頭痛的主要途徑，體現(xiàn)了清震湯可通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療偏頭痛，可為后續(xù)產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。