雞血藤木質(zhì)部與韌皮部中代謝產(chǎn)物的差異性分析

陳 菲，梅余琪，劉訓(xùn)紅*

1如皋市中醫(yī)院，如皋 226500；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023

雞血藤為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖，具有活血補血，調(diào)經(jīng)止痛，舒筋活絡(luò)的功效[1]，歷版《中國藥典》均有收載。雞血藤藥材主要由木質(zhì)部和韌皮部組成，木質(zhì)部紅棕色或棕色，導(dǎo)管孔多數(shù)；韌皮部有樹脂狀分泌物呈紅棕色至黑棕色，與木質(zhì)部相間排列呈數(shù)個同心性橢圓形環(huán)或偏心性半圓形環(huán)[1]。雞血藤主要含有黃酮類、萜類、甾醇類、蒽醌類、有機酸類等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗貧血等多種藥理活性[2]。近年來，國內(nèi)外對雞血藤的質(zhì)量研究報道較少，且多集中于對其活性成分的定量研究[3-5]，對雞血藤不同組織部位中代謝產(chǎn)物的差異性研究尚屬空白。

本實驗基于植物代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路和方法[6-9]，采用超快速液相色譜-串聯(lián)四級桿飛行時間高分辨質(zhì)譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析，篩選并鑒定雞血藤木質(zhì)部與韌皮部中的顯著差異代謝產(chǎn)物，并挖掘其對應(yīng)的潛在靶點及通路，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，以期進一步明確雞血藤的功效物質(zhì)基礎(chǔ)和主要調(diào)控靶點，并為探討雞血藤藥材的品質(zhì)形成機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

SIL-20A XR超快速液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；Triple TOFTM5600 System-MS/MS高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；Q-500B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)；ME36S型電子分析天平(百萬分之一，德國賽多利斯公司)；BSA224S型電子分析天平(萬分之一，德國賽多利斯公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)；KQ-500B超聲波清洗機(500 W、40 kHz，昆山超聲儀器有限公司)；H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；色譜甲醇(批號143135，江蘇漢邦科技有限公司)。

色譜甲醇(批號143135，江蘇漢邦科技有限公司)；色譜三氯甲烷(批號20190201，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；色譜乙腈(批號SHBL8516，德國默克公司)；甲酸(批號G1326020，德國默克公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。共收集到來自老撾6個批次的雞血藤藥材，均為橢圓形或不規(guī)則的干燥斜切片，厚度約為0.3～1 cm。每批樣品均被仔細地分離木質(zhì)部和韌皮部，且無相互粘連。所有藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖，留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實驗室。

1.2 測試條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Extend-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫條件：0～8 min，5%→10% B；8～14 min，10%→25% B；14～17 min，25%→33% B；17～24 min，33%→45% B；24～31 min，45%→58% B；31～38 min，58%→83% B；38～40 min，83%→83% B；40～42 min，83%→95% B；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：2.0 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正、負離子模式下采集數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500；離子源溫度(temperature，TEM)：550 ℃；氣簾氣(curtain gas，CUR)流速：40 L/min；霧化氣(nebulizer gas，GS1)流速：55 L/min；輔助氣(auxiliary gas，GS2)流速：55 L/min；噴霧電壓(ion spray voltage，IS)正離子模式4 500 V，負離子模式-4 500 V；去簇電壓(declustering potential，DP)正離子模式100 V，負離子模式-100 V。

1.3 供試品溶液制備

樣品粉末粉碎過50目篩。取樣品約1.0 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL三氯甲烷-甲醇(4∶1，V/V)溶液，密閉，稱重，室溫下超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)60 min，放置冷卻，再次稱重，加入三氯甲烷-甲醇(4∶1，V/V)溶液至初始重量，過濾，將濾液離心10 min(12 000 rpm)，取上清液，稀釋10倍后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

1.4 色譜圖處理與統(tǒng)計分析

將經(jīng)過MarkerView 1.2.1預(yù)處理的樣品數(shù)據(jù)，導(dǎo)入到SIMCA-P 13.0中進行PCA、OPLS-DA模型的預(yù)測分析。以PCA初步判斷總體樣本的聚散情況，如果樣本之間聚集在一起，說明這些樣本差異性小；反之樣本之間距離越遠，說明樣本之間差異性越大。在PCA分析的基礎(chǔ)上，通過OPLS-DA進行樣本的具體分類，在模型參數(shù)中，R2X、R2Y越接近于1表示所建立的模型越穩(wěn)定，Q2>0.5表示模型具有較高的可靠性和預(yù)測度[10,11]。根據(jù)OPLS-DA中變量權(quán)重值(VIP>1)和t檢驗中P值(P<0.05)篩選差異化合物。

1.5 差異化學(xué)成分鑒定

根據(jù)一級質(zhì)譜確定化合物的精確相對分子質(zhì)量，二級質(zhì)譜獲得碎片信息，結(jié)合對照品裂解信息、參考文獻和前期研究基礎(chǔ)[12]等推測和鑒定差異化合物的結(jié)構(gòu)信息。以各樣品中各物質(zhì)對應(yīng)的峰面積表示差異成分的量，根據(jù)同一物質(zhì)峰面積的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計算各樣品中該物質(zhì)的相對含量并進行比較[10,11]。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)中，根據(jù)吸收、分布、代謝與排泄(ADME)的相關(guān)參數(shù)篩選差異化合物中的中藥活性組分并獲取相關(guān)蛋白靶點；通過UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將預(yù)測出的靶點蛋白名轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因名；利用String平臺(https://string-db.org/)進行蛋白質(zhì)相互作用分析，構(gòu)建靶點蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network,PPI network)并挖掘網(wǎng)絡(luò)中潛在的蛋白質(zhì)功能模塊；采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)平臺分析“藥物-成分-靶點”及其參與的生物過程及通路，而后采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建雞血藤“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)[13]。

2 結(jié)果

2.1 條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了不同流動相(乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水-乙腈和0.1%甲酸水-甲醇溶液)對多組分的分離效果。結(jié)果表明，以0.1%甲酸水-乙腈為流動相時，各色譜峰具有較好的峰形及分離效果。通過比較正離子模式和負離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大部分化合物可以在正離子模式下被鑒定，少數(shù)化合物可以在負離子模式下被鑒定。因此，選擇在正離子和負離子兩種模式下收集數(shù)據(jù)。圖1為雞血藤木質(zhì)部與韌皮部樣品在正、負離子模式下的基峰圖。

圖1 正離子模式下雞血藤木質(zhì)部(A)與韌皮部(B)樣品、負離子模式下雞血藤木質(zhì)部(C)與韌皮部(D)樣品的基峰圖Fig.1 Base peak chromatograms of xylem (A)and phloem (B)in positive ion mode and xylem (C)and phloem (D)in negative ion mode of Spatholobi Caulis

2.1.2 樣品處理優(yōu)化

為了優(yōu)化提取工藝，對不同濃度的提取溶劑(30%、50%、70%和90%的甲醇溶液；30%、50%、70%和90%的乙醇溶液；氯仿-甲醇(4∶1，V/V))、提取時間(30、60、90 min)和藥液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 g/mL)進行了單因素考察。通過比較兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素和芒柄花素的提取效率，最終確定室溫下樣品用1∶10的氯仿-甲醇(4∶1，V/V)溶液超聲提取60 min。

2.2 PCA分析

采用PCA對雞血藤木質(zhì)部與韌皮部樣品進行分類與分析。圖2為雞血藤木質(zhì)部與韌皮部樣品分別在正、負離子模式下的PCA得分圖。在正離子模式中，t[1]=0.526，t[2]=0.266，其中R2[X]=0.962，Q2=0.554；在負離子模式中，t[1]=0.825，t[2]=0.074，其中R2[X]=0.947，Q2=0.790，表示模型成立可靠，具有良好解釋能力和預(yù)測能力。在模型成立的前提下，木質(zhì)部與韌皮部在PCA模型中各自聚為一類，具有較好的分類效果，表明二者之間存在一定的差異。

圖2 雞血藤木質(zhì)部與韌皮部樣品在正(A)、負(B)離子模式下的PCA得分圖Fig.2 PCA score scatter plots of xylem and phloem of Spatholobi Caulis in positive (A)and negative (B)ion modes注：“X”表示木質(zhì)部；“P”表示韌皮部，下同。Note;“X”is xylem;“P”is phloem,the same below.

2.3 OPLS-DA分析

為減少組內(nèi)隨機誤差，突出組間輪廓差異，彌補無監(jiān)督模型的缺陷，采用有監(jiān)督的OPLS-DA分析建立判別模型，并對預(yù)測集進行預(yù)測[14]。圖3、圖4為雞血藤木質(zhì)部與韌皮部樣品在正、負離子模式中的OPLS-DA分布圖(A)、VIP得分圖(B)和S-Plot圖(C)，其中，正離子模式R2[X]=0.862，Q2=0.959，負離子模式R2[X]=0.860，Q2=0.968。對 OPLS-DA 模型進行交叉驗證方差分析(CV-ANOVA)，以P值反映組間差異的大小，結(jié)果顯示正離子模式下P=0.012 158 1，負離子模式下P=2.046 69×10-4，二者P值均小于0.05，表明模型穩(wěn)定可靠。由VIP得分圖(B)和S-Plot圖(C)可知對兩組分類貢獻較大的成分(VIP>1)，結(jié)合P<0.05，正離子模式共篩選出32個差異成分，負離子模式共篩選出27個差異成分。

圖3 雞血藤木質(zhì)部與韌皮部樣品在正離子模式下的OPLS-DA分布圖(A)、VIP得分圖(B)和S-Plot圖(C)Fig.3 OPLS-DA score scatter (A),VIP plot (B)and S-plot (C)of xylem and phloem of Spatholobi Caulis in positive ion mode

圖4 雞血藤木質(zhì)部與韌皮部樣品在負離子模式下的OPLS-DA分布圖(A)、VIP得分圖(B)和S-Plot圖(C)Fig.4 OPLS-DA score scatter (A),VIP plot (B)and S-plot (C)of xylem and phloem of Spatholobi Caulis in negative ion mode

2.4 差異化學(xué)成分鑒定與相對定量

通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的精確相對分子質(zhì)量和裂解碎片信息，結(jié)合對照品信息、相關(guān)參考文獻和數(shù)據(jù)庫對上述顯著差異成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定出其中13個差異成分(見表1)。以這13種差異成分在各樣品中的峰面積作為相對含量，計算雞血藤木質(zhì)部與韌皮部中顯著差異成分的相對含量平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。如圖5所示，13個差異成分在木質(zhì)部中的含量均顯著高于韌皮部。

表1 雞血藤木質(zhì)部與韌皮部中差異化學(xué)成分的鑒定Table 1 Identification of different constituents in the xylem and phloem of Spatholobi Caulis

圖5 雞血藤木質(zhì)部與韌皮部中差異化合物的相對含量變化Fig.5 The comparison of relative contents of differential chemical constituents in xylem and phloem of Spatholobi Caulis

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

基于上述差異成分，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段初步探究雞血藤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在的分子機制[13,15-17]。

2.5.1 相關(guān)靶點篩選

根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18的2個ADME屬性值[18]，對上述差異成分初步篩選，獲得其中5個活性化合物(芒柄花素、美迪紫檀素、黃甘草苷、甘草素和維斯體素)及其作用的222個蛋白質(zhì)靶點。

2.5.2 靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

將獲得的222個靶點蛋白以gene symbol形式導(dǎo)入在線String 11.0軟件，物種選擇為人(homo sapiens)，最高置信度蛋白交互參數(shù)評分值>0.9，其他參數(shù)設(shè)置不變，將得到的相互作用參數(shù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。由于PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白的作用的是相互的，所以通常歸為無向圖。PPI復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中存在部分密度較高的區(qū)域稱為community或module。module內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)是PPI網(wǎng)絡(luò)的潛在子網(wǎng)，子網(wǎng)連線密度較高，區(qū)域部分連線少，因此module被認為是具有生物學(xué)意義的集合[13]。PPI網(wǎng)絡(luò)中的幾個得分較高的module見圖6，每個節(jié)點代表1種蛋白，節(jié)點之間的連線代表2個蛋白之間的相互作用。

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)中的moduleFig.6 Modules in PPI network

對PPI進行拓撲特征分析，選取在“中介中心性”(betweenness)和“接近中心性”(closeness)2個參數(shù)均大于等于中位數(shù)、“度中心性”(degree)大于等于兩倍中位數(shù)作為核心靶點，經(jīng)篩選后共得到24個重要核心靶點，即LCK、PTPN1、HCK、SRC、TNF、GCGR、AGTR1、PIK3CA、EGFR、PIK3R1、YWHAG、PRKACA、HSP90AA1、MAP2K1、ESR1、MMP9、EPHB2、PIK3CB、VEGFA、MMP2、IGF1R、PDPK1、IL2、KDR，其中與維斯體素相關(guān)的靶點數(shù)較多。

2.5.3 功能富集分析與通路分析

利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對24個核心靶點蛋白進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能；KEGG富集分析可以得到潛在靶點所富集的信號通路[19]。GO分析結(jié)果顯示，根據(jù)P<0.01共獲得生物信息條目79個，包括生物過程(BP)條目49個、細胞組成(CC)條目10個、分子功能(MF)條目20個。其中BP主要涉及血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)自磷酸化、凋亡過程的負調(diào)控等；CC主要涉及細胞質(zhì)膜、細胞膜和細胞質(zhì)等；MF主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、ATP結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合等(見表2)。同時，根據(jù)P<0.01獲得KEGG通路富集條目67個，主要涉及蛋白聚糖作用癌癥、雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路、局灶性粘連、癌癥信號通路等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(見圖7)。

表2 雞血藤相關(guān)靶點的GO分析Table 2 GO analysis of related targets in Spatholobi Caulis

圖7 雞血藤相關(guān)靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果(前15位)Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis of related targets in Spatholobi Caulis (Top 15)

2.5.4 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)上述成分-靶點、靶點-通路的對應(yīng)關(guān)系，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制出“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過網(wǎng)絡(luò)圖進行可視化展示，如圖8所示。由網(wǎng)絡(luò)圖可知，雞血藤是通過多靶點、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用的。根據(jù)Cytoscape 3.7.2軟件分析結(jié)果，以化合物、靶點蛋白、信號通路的連接度(degree)為參考，發(fā)現(xiàn)化合物維斯體素(degree=9)的連接度較高，提示該化合物可能是雞血藤的關(guān)鍵活性成分；PIK3R1(degree=55)、PIK3CA(degree=58)、MAP2K1(degree=49)、PIK3CB(degree=63)的連接度顯著高于其他靶點，表明這4個靶點發(fā)揮的作用可能更為關(guān)鍵；蛋白聚糖作用癌癥(degree=10)、癌癥通路(degree=10)、PI3K-Akt信號通路(degree=8)連接度高于其他通路，表明雞血藤中的差異標(biāo)志物主要對上述信號通路發(fā)揮重要作用。

圖8 雞血藤“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.8 “Component-target-pathway”network of Spatholobi Caulis

3 討論與結(jié)論

同一植物在不同環(huán)境、不同部位、不同產(chǎn)地或者不同的炮制方法，所得到的代謝物均有差異。這些代謝物結(jié)構(gòu)迥異，數(shù)量龐大，可以使植物很好地適應(yīng)環(huán)境的變化，植物類中藥的次生代謝物往往是與藥效相關(guān)的活性成分，也通常作為研究中藥材藥效學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)[20]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于對“成分-靶標(biāo)-通路-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)的理解，分析并觀察藥物對復(fù)雜疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，并利用可視化大規(guī)模數(shù)據(jù)集成直觀、清晰地觀察網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點之間的相互作用，為研究復(fù)雜的藥物與疾病機制靶標(biāo)提供了新的平臺[21]。

本實驗基于UFLC-Triple TOF-MS/MS技術(shù)分析雞血藤木質(zhì)部與韌皮部中化學(xué)成分的差異，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘其對應(yīng)的潛在靶點與通路，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。木質(zhì)部與韌皮部樣品在PCA模型中得到有效區(qū)分，通過進一步的OPLS-DA分析與t檢驗，對差異化合物進行篩選與鑒定，共鑒定出其中13個差異成分。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，進一步篩選、挖掘其對應(yīng)的潛在靶點及通路。基于degree值，發(fā)現(xiàn)化合物維斯體素可能是雞血藤的關(guān)鍵活性成分；PIK3R1、PIK3CA、MAP2K1、PIK3CB這4個靶點發(fā)揮的作用可能較為關(guān)鍵；雞血藤中的差異標(biāo)志物主要對蛋白聚糖作用癌癥、癌癥通路、PI3K-Akt信號通路發(fā)揮重要作用。

雞血藤始載于《本草備要》，記載“雞血藤，活血舒筋……血嗽血，諸病要藥”[22]，具有“去淤血，生新血”的功效[23]。目前，雞血藤已逐步證實能通過多種機制抑制癌癥。Sun等[24]研究了雞血藤柱色譜提取物對乳腺癌細胞株MCF7的影響及其可能的作用機制。結(jié)果顯示雞血藤提取物不僅減少了MCF7細胞的存活率，還可抑制核內(nèi)pER活性并通過抑制MAPK PI3K/AKT信號通路導(dǎo)致乳腺癌細胞凋亡。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者的首要死因，研究表明腫瘤能夠誘導(dǎo)血小板向其聚集從而保護腫瘤細胞的生存以及免疫逃逸[25]。有實驗證實雞血藤提取物能有效地抑制腫瘤細胞所誘導(dǎo)的血小板聚集，并能夠顯著降低乳腺癌細胞4T1的轉(zhuǎn)移率，其藥效機制可能與抑制P-selectin，糖蛋白Ⅵ等的mRNA水平的表達有關(guān)[26]。陳丹丹等采用腋下注射腫瘤細胞的造模方法，研究了雞血藤水提物對S180腫瘤的抑制效果，結(jié)果雞血藤水提物能顯著抑制S180腫瘤細胞的生長，表明其具有良好的抗腫瘤活性[27]。前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與雞血藤中關(guān)鍵成分相關(guān)度較高的通路主要是蛋白聚糖作用癌癥、癌癥通路、PI3K-Akt信號通路等，結(jié)合近年來的相關(guān)文獻可知，這一結(jié)果與目前已研究的雞血藤的藥理作用基本一致。

綜上，本研究運用植物代謝組學(xué)的思路，篩選并表征了雞血藤木質(zhì)部與韌皮部中的差異化合物，同時結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，建立雞血藤物質(zhì)基礎(chǔ)-靶點-通路關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果可為揭示不同組織部位對雞血藤代謝產(chǎn)物合成積累的影響提供科學(xué)依據(jù)，為進一步明確雞血藤的功效物質(zhì)基礎(chǔ)和主要調(diào)控靶點提供一定的基礎(chǔ)資料，并為探討雞血藤藥材的品質(zhì)形成機制提供新的方向。但限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法論的局限性以及中藥組分的復(fù)雜性，后續(xù)仍需基礎(chǔ)與臨床研究予以進一步驗證。